İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması

SUSEVER, Serdar; YEĞENOĞLU, Yıldız

İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması

Serdar SUSEVER, (İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye)

Yıldız YEĞENOĞLU (İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye)

Dicle Tıp Dergisi

3 0

Yıl: 2012 Cilt: 39 Sayı: 2 Sayfa Aralığı: 242 - 250 Metin Dili: Türkçe İndeks Tarihi: 29-07-2022

İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması

Öz:

Amaç: Bu çalışmanın amacı immun sistemi baskılı hastalardan elde edilen klinik örneklerden izole edilen Candida türlerinde PCR tekniğinin ve RFLP ve sekans analizi ile antifungal direnç genlerinin araştırılmasıdır. Gereç ve yöntem: Çalışmada immün sistemi baskılı 200 hastadan alınan klinik örnekler (96 bronkoalveoler lavaj, 56 biyopsi-apse, 8 kan, 15 periton diyaliz sıvısı, 15 plevra sıvısı, 5 beyin omurilik ve 5 perikard sıvısı) geleneksel ve moleküler yöntemler ile incelenmiş ve sonuçlar değerlendirilmiştir. Örneklerden mantar DNA’sı saptandıktan sonra elde edilen ürünün, multipleks PCR yardımı ile tür düzeyinde tanısı yapılmış, antifungal direnci E-test, direnç genleri ise RFLP analizi ile saptanmıştır. Bulgular: İkiyüz örneğin 30’unda (%15) kültür yöntemleri ile pozitif sonuç alınmış [20 Candida albicans (%67), beş Candida parapsilosis (%17), beş Candida tropicalis (%17)], 170 (%85) örnekte üreme olmamıştır. Genel primerler ile yapılan PCR testi sonucunda kültürleri olumlu bulunan 30 örneğin tümünün mantar DNA’sı içerdiği belirlenmiştir. İzole edilen suşların biri E-test yöntemiyle flukanozole dirençli, ikisi flukanozole doza bağlı duyarlı olarak saptanırken 27’si duyarlı olarak bulunmuştur. Seçilen uygun primerler ile BamHI ve SalI enzimleri kullanılarak RFLP uygulanmış, yapılan analizler sonucunda dirençli bir C.albicans suşunda 600 bp’lik bant görülmüştür. Candida dubliniensis (950 bp) ve Candida krusei (360 bp) ile yapılan multipleks PCR optimizasyonunda başarı sağlanmıştır. Suşların ERG genine uygun primer çiftleri ile PCR’ları yapıldıktan sonra yapılan sekans analizi sonucunda dirençli C.albicans suşu referans gen ile karşılaştırıldığında D132E, E216D mutasyonları belirlenmiştir. Sonuç: Moleküler test yöntemleri özellikle immün sistemi baskılanmış hasta populasyonunun kısa sürede doğru tedavisine olanak sağladıkları için yaşamsal açıdan önemlidir.

Anahtar Kelime:

Konular: Mikrobiyoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji

The identification of Candida species isolated from clinical specimens of immunocompromised patients with PCR and determination of antifungal resistance genes with RFLP and sequencing analysis

Öz:

Objectives: The aim of this study is to investigate PCR technique and antifungal resistance genes with RFLP and sequencing analysis in Candida species isolated from clinical specimens of immune-compromised patients. Materials and methods: Clinical samples (96 bronchoalveolar lavages, 56 biopsy-abscess, 8 blood specimens, 15 peritoneal fluid specimens, 15 pleural fluid, 5 cerebrospinal fluid and 5 pericard fluid specimens) from 200 immunosuppressed patients were studied by conventional and molecular methods. Antifungal susceptibility testing was performed by the E-test method. Firstly, fungal DNA was isolated from specimens, and then the resultant products are defined with multiplex PCR. Antifungal resistance and resistance genes were established by E-test and RFLP analysis. Results: Thirty of 200 samples (15%) were culture positive [20 Candida albicans (67%), five Candida parapsilosis (17%), five Candida tropicalis (17%)], and 170 of samples were found culture negative (85%). PCR with the universal primers detected fungal DNA in all 30 culture positive samples. One strain was determined as resistant; 2 strains were dose dependent susceptible and 27 strains were sensitive to fluconazole by E-test. The resistance gene (ERG11) was detected by BamHI and SalI enzymes revealed fluconazole resistance in one of C.albicans strains. The identification was successful in Candida dubliniensis (950 bp) and Candida krusei (360 bp) with multiplex PCR. D132E and E216D mutations were detected in sequencing of ERG 11 gene of this isolate and compared with reference gene in GenBank by clustal analysis. Conclusion: The molecular test methods supplies correct therapy rather early in immunosuppressive patients therefore it is important for the survival.

Anahtar Kelime:

Konular: Mikrobiyoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Erişime Açık

1. Hazen KC, Howell SA. Candida, Cryptococcus, and other yeasts of medical importance, “Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH (eds): Manual of Cilinical Microbiology, 8th edn.” ASM Press,Washington, 2003:1693-710.
2. Kurtz MB, Cortelyou MW, Kirsch DR. Integrative transformation of Candida albicans, using a cloned Candida ADE2 gene. Mol Cell Biol 1986;6(1):142–9.
3. Chang HC, Leaw SN, Huang AH, Wu TL, Chang TC. Rapid identification of yeasts in positive blood cultures by a multiplex PCR method. J Clin Microbiol 2001;39(10):3466-71.
4. Luo G, Mitchell TG. Rapid identification of pathogenic fungi directly from cultures by using multiplex PCR., J Clin Microbiol 2002;40(8):2860-5.
5. Romeo O, Racco C, Criseo G. Amplification of the hyphal wall protein 1 gene to distinguish Candida albicans from Candida dubliniensis. J Clin Microbiol 2006;44(7):2590-2.
6. Sanglard D, Bile J. Current understanding of the modes of action and resistance mechanisms to conventional and emerging antifungal agents for treatment of Candida of infections, “Calderone RA (ed): Candida and Candidiasis, 1th edn” kitabında ASM Press, Washington, 2002:349-83.
7. Whelan WL, Partridge RM, Magee PT. Heterozygosity and segregation in Candida albicans. Mol Gen Genet 1980; 180(1):107–13.
8. Sanglard D, Ischer F, Bille J. Role of ATP-binding-cassette transporter genes in high-frequency acquisition of resistance to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother 2001;45(4):1174-83.
9. Arıkan S. Fungal hastalıklarda genomik ve proteomiklerin yeri ve önemi. ANKEM Derg 2009;23(Ek 2): 53-6.
10. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI): Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts, Approved Standard 3rd edn, CLSI Document M27-A3, Clinical and Laboratory Standards Institute,Wayne, PA 2008;28(14).
11. Xu Y, Chen L, Li C. Susceptibility of clinical isolates of Candida species to fluconazole and detection of Candida albicans ERG11 mutations. J Antimicrob Chemother 2008;61(4):798-804.
12. Alpar R. Spor Bilimlerinde Uygulamalı İstatistik, 2. Baskı, s.219-55, Nobel Tıp Kitabevi, İstanbul (2001).
13. Günalp A. Gen ve Moleküler Biyoloji, 1st edn, , Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 1965;1:226-63.
14. Hawthorne DC, Mortimer RK. Chromosome mapping in Saccharomyces centromere-linked genes. Genetics 1960;45(8):1085-110.
15. Shin JH, Nolte FS, Morrison CJ. Rapid identification of Candida species in blood cultures by a clinically useful PCR method. J Clin Microbiol 1997;35(6):1454-9.
16. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE et al. Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edn, John Wiley&Sons, New York, 1995:642-50.
17. Einsele H, Hebart H, Roller G, Loffler J, Rothenhofer I, Muller CA. Detection and identification of fungal pathogens in blood by using molecular probes. J Clin Microbiol 1997;35(6):1353-60.
18. Maaroufi Y, Heymans C, De Bruyne JM, Duchateau V, Rodriguez- Villalobos H. Rapid detection of Candida albicans in clinical blood samples by using a TaqMan-based PCR assay. J Clin Microbiol 2003;41(7):3293-8.
19. Li YL, Leaw SN, Chen JH, Chang HC, Chang TC. Rapid identification of yeasts commonly found in positive blood cultures by amplification of the internal transcribed spacer regions 1 and 2. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003;22(11):693-6.
20. Skladny H, Buchheidt D, Baust C, Krieg-Schneider F, Seifarth W, Leib-Mosch C. Specific detection of Aspergillus species in blood and bronchoalveolar lavage samples of immunocompromised patients by two-step PCR., J Clin Microbiol 1999;37(12):3865-71.
21. Hayette MP, Vaira D, Susin F, Boland P, Christiaens G, Melin P. Detection of Aspergillus species DNA by PCR in bronchoalveolar lavage fluid. J Clin Microbiol 2001;39(6):2338-40.
22. Whıte TC, Marr KA, Bowden RA. Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev 1998;11(2):382-402 .
23. Haitao Ji, Zhang W, Zhou Y, Zhang M, Zhu J, Song Y. A three-dimensional model of lanosterol 14α-demethylase of Candida albicans and its interaction with azole antifungals. J Med Chem 2000;43(13):2493-505.
24. Favre B, Didmon M, Ryder NS. Multiple amino acid substitutions in lanosterol 14α-demethylase contribute to azole resistance in Candida albicans. Microbiology 1999;145(10):2715-25.
25. Marichal P, Koymans S, Willemsens S, Bellens D, Verhasselt P, Luyten W, Borgers M,Ramaekers FC, Odds FC and Vanden Bossche H. Contribution of mutations in the- 111cytochrome P450 14α-demethylase (Erg 11p, Cyp 51p) to azole resistance in Candida albicans. Microbiology 1999;145: 2701-13.
26. Löffler J, Kelly SL, Hebart H, Schumacher U, Lass- Flörl C, Einsele H. Molecular analysis of cyp 51 from fluconazole resistant Candida albicans strains. FEMS Microbiol Lett1997;151:263-8.

APA	SUSEVER S, YEĞENOĞLU Y (2012). İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. , 242 - 250.
Chicago	SUSEVER Serdar,YEĞENOĞLU Yıldız İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. (2012): 242 - 250.
MLA	SUSEVER Serdar,YEĞENOĞLU Yıldız İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. , 2012, ss.242 - 250.
AMA	SUSEVER S,YEĞENOĞLU Y İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. . 2012; 242 - 250.
Vancouver	SUSEVER S,YEĞENOĞLU Y İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. . 2012; 242 - 250.
IEEE	SUSEVER S,YEĞENOĞLU Y "İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması." , ss.242 - 250, 2012.
ISNAD	SUSEVER, Serdar - YEĞENOĞLU, Yıldız. "İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması". (2012), 242-250.

APA	SUSEVER S, YEĞENOĞLU Y (2012). İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. Dicle Tıp Dergisi, 39(2), 242 - 250.
Chicago	SUSEVER Serdar,YEĞENOĞLU Yıldız İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. Dicle Tıp Dergisi 39, no.2 (2012): 242 - 250.
MLA	SUSEVER Serdar,YEĞENOĞLU Yıldız İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. Dicle Tıp Dergisi, vol.39, no.2, 2012, ss.242 - 250.
AMA	SUSEVER S,YEĞENOĞLU Y İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. Dicle Tıp Dergisi. 2012; 39(2): 242 - 250.
Vancouver	SUSEVER S,YEĞENOĞLU Y İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması. Dicle Tıp Dergisi. 2012; 39(2): 242 - 250.
IEEE	SUSEVER S,YEĞENOĞLU Y "İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması." Dicle Tıp Dergisi, 39, ss.242 - 250, 2012.
ISNAD	SUSEVER, Serdar - YEĞENOĞLU, Yıldız. "İmmün sistemi baskılı hastaların klinik örneklerinden soyutlanan Candida türlerinin PCR ile belirlenmesi ve antifungal direnç genlerinin RFLP ve sekans analizi ile saptanması". Dicle Tıp Dergisi 39/2 (2012), 242-250.