Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi

BIYIK, Fatma; YEĞENOĞLU, Yıldız; SUSEVER, Serdar; GRASER, Yvonne; ÖZARMAĞAN, Güzin

Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi

Fatma BIYIK, (İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye)

Yvonne GRASER, (Humboldt Universitesi, Mikrobiyoloji ve Hijyen Enstitüsü, Berlin, Almanya)

Serdar SUSEVER, (İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye)

Güzin ÖZARMAĞAN, (İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi, Deri ve Zührevi Hastalıklar Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye)

Yıldız YEĞENOĞLU (İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye)

Türkderm-Deri Hastalıkları ve Frengi Arşivi

27 2

Yıl: 2013 Cilt: 47 Sayı: 1 Sayfa Aralığı: 26 - 32 Metin Dili: Türkçe İndeks Tarihi: 29-07-2022

Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi

Öz:

Amaç: Dermatofitler geleneksel izolasyon besiyerlerinde fırsatçı mantarlar gibi birkaç günde izole edilemezler. Uygun ortamda üreme süreleri yaklaşık olarak iki haftayı kapsar ve identifikasyonunda tipik makroskopik, mikroskopik özellikler ve biyokimyasal testler gibi geleneksel yöntemlerden yararlanılır. Ancak fenotipik özellikler ile her zaman başarılı sonuçların alınamayışı, bu nedenle tanı ve tedavide oluşabilecek gecikme ve sorunlar, nükleik asit amplifikasyon temeline dayalı yöntemlerden yararlanmayı gerekli kılmıştır. Bu çalışmada geleneksel yöntemler ile identifikasyonu yapılan 56 dermatofit suşunun moleküler yöntemlerle de identifiye edilerek her iki yöntemin birbirleriyle uyum derecelerinin araştırılması ve moleküler yöntemlerin rutin laboratuvarlarda kullanılabilirliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Dermatofitoz ön tanılı 270 hastanın çeşitli klinik örnekleri (saç+saçlı deri, deri ve tırnak kazıntısı) öncelikle geleneksel yöntemlerle incelenmiş; Sabouraud dekstroz agar, mısır unlu agar ve patates dekstroz agar besiyerleri izolasyon amacı ile kullanılmıştır. Gerektiğinde üreyi hidrolize etme, Trichophyton agar besiyerlerindeki çeşitli vitaminleri kullanabilme özellikleri araştırılmıştır. Moleküler tanı amacı ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve sekans analizi yapılmıştır. Bulgular: Geleneksel yöntemler ile suşların 37 (%66,1)’sinin Trichophyton (T) rubrum, dördünün (%7,1) T. mentagrophytes, dördünün (%7,1) T. tonsurans, birinin (%1,8) T. violaceum, sekizinin (%14,3) Trichophyton cinsinden, birinin (%1,8) Microsporum(M) canis, birinin (%1,8) Microsporum cinsinden olduğu saptanmıştır.Moleküler (T1 PCR, 25 GA PCR, ITS PCR-RFLP ve sekans analizi) identifikasyon sonuçlarına göre ise 41 suş (%73,2) T. rubrum, 10 suş (%17,8) T. interdigitale, bir suş (%1,8) T. violaceum, iki suş (%3,6) M. canis, bir suş (%1,8) Peacilomyces lilacinus, bir suş (%1,8) Aspergillus fumigatus olarak belirlenmiştir. Sonuç: Çalışmanın sonuçları identifikasyonlarında zorluk çekilen dermatofitlerin cins ve tür düzeyinde tanımlanmasında moleküler yöntemler ile hızlı ve güvenilir sonuçlar alındığını göstermiştir.

Anahtar Kelime:

Konular: Mikrobiyoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji Biyokimya ve Moleküler Biyoloji

The place of molecular methods in the identification of dermatophytes and the determination of their feasibility

Öz:

Background and Design: Unlike opportunistic fungi, dermatophytes cannot be isolated on the conventional culture media in a few days. Their growing periods cover approximately two weeks in a suitable media and identification are made with conventional methods as typical macroscopic and microscopic appearance. However, successful results are not always obtained with the phenotypic features, and thus, diagnostic problems and delay in diagnosis and treatment may arise. For this reason, the methods based on nucleic acid amplification have been necessary. In this study, we aimed to identify 56 dermatophytes strains, which were identified by conventional methods, by molecular methods and to investigate the correlation between the two methods and to determine the usability of molecular methods in routine laboratories. Materials and Methods: Several clinical samples of 270 patients with suspected dermatophytoses (hair+scalp, skin and nail scrapings) were examined by conventional methods; Sabouraud dextrose agar, corn meal agar and potato dextrose agar were used for isolation. In case of necessity to hydrolyze urea, to be used different vitamins in Trichophyton agar media were investigated. Polymerase chain reaction (PCR) and sequence analyses were done for the molecular diagnosis. Results: Using conventional methods, 37 strains (66,1%) were identified as Trichophyton(T) rubrum, four (7.1%) - T.mentagrophytes, four (7.1%) - T.tonsurans, one (1.8%) - T.violaceum, eight (14.3%) - Trichophyton spp., one (1.8%) - Microsporum(M) canis, and one (1.8%) - Microsporum spp. According to the molecular and sequence analyses results (T1PCR, 25GAPCR, ITSPCR-RFLP and sequence analyses), 41 (73.8%) strains were identified as T.rubrum, 10 (17.8%) - T.interdigitale, one (1.8%) - T. violaceum, two (3.6%) - M. canis, one (1.8%) - Peacilomyces lilacinus, and one (1,8%) - Aspergillus fumigatus. Discussion: This study suggests that, molecular methods offer fast and reliable results in identification of dermatophytes.

Anahtar Kelime:

Konular: Mikrobiyoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji Biyokimya ve Moleküler Biyoloji

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Erişime Açık

1. Padhye AA, Summerbell RC: Medical Mycology. The dermatophytes. Ed. Merz WG, Hay RJ, Washington, USA ASM Pres, 2005;220-43.
2. Liu D, Coloe S, Baird R, Pedersen J: Application of PCR to the identification of dermatophyte fungi. J Med Microbiol 2000;49:493-7.
3. Machouart-Dubach M, Lacroix C, de Chauvin MF, et al: Rapid discrimination among dermatophytes, Scytalidium spp., and other fungi with a PCR- restriction fragment length polymorphism ribotyping method. J Clin Microbiol 2001;39:685-90.
4. Ninet B, Jan I, Bontems O, et al: Identification of dermatophyte species by 28S ribosomal DNA sequencing with a commercial kit. J Clin Microbiol 2003;41:826-30.
5. Weitzman I, Summerbell RC: The dermatophytes. Clin Microbiol Rev 1995; 8:240-59.
6. Larone DH: Medically important fungi a guide to identification. Ed. Washington, ASM Pres, 2011:245-6.
7. Kwon-Chung KJ, Bennet JE: Medical Mycology. Ed. Philadelphia, London Lea&Febiger, 1992;105-97.
8. Rezusta A, Rubio MC, Alejandre MC: Differentiation between Trichophyton mentagrophytes and T. rubrum by sorbitol assimilation. J Clin Microbiol 1991;29:219-20.
9. Sinski JT, Van Avermaete D, Kelley LM: Analysis of tests used to differentiate Trichophyton rubrum from Trichophyton mentagrophytes. J Clin Microbiol 1981;13:62-5.
10. Sudman MS, Schmitt JA: Differentiation of Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes by pigment production. Appl Microbiol 1965;13:290.
11. Pounder JI, Williams S, Hansen D, et al: Repetitive-sequence-PCR-based DNA fingerprinting using the Diversilab system for identification of commonly encountered dermatophytes. J Clin Microbiol 2005;43:2141-7.
12. Rippon JW: Medical Mycology. Philadelphia, WB Saunders Company, Harcourt Brace Jovanovich Inc, 1988;154-275.
13. Makimura K, Tamura Y, Mochizuki T, et al: Phylogenetic classification and species identification of dermatophyte strains based on DNA sequences of nuclear ribosomal internal transcribed spacer 1 regions. J Clin Microbiol 1999;37:920-4.
14. Gräser Y, el Fari M, Presber W, Sterry W, Tietz HJ: Identification of common dermatophytes (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton) using polymerase chain reactions. Br J Dermatol 1998;138:576-82.
15. Jackson CJ, Barton RC, Evans EG: Species identification and strain differentiation of dermatophyte fungi by analysis of ribosomal-DNA intergenic spacer regions. J Clin Microbiol 1999;37:931-6.
16. Mochizuki T, Ishizaki H, Barton RC, et al: Restriction fragment length polymorphism analysis of ribosomal DNA intergenic regions is useful for differentiating strains of Trichophyton mentagrophytes. J Clin Microbiol 2003;41:4583-8.
17. Baek SC, Chae HJ, Houh D, Byun DG, Cho BK: Detection and differentiation of causative fungi of onychomycosis using PCR amplification and restriction enzyme analysis. Int J Dermatol 1998;37:682-6.
18. Kawasaki M, Anzawa K, Ushigami T, Kawanishi J, Mochizuki T: Multiple gene analyses are necessary to understand accurate phylogenetic relationships among Trichophyton species. Med Mycol J 2011;52:245-54.
19. Monod M, Bontems O, Zaugg C, et al: Fast and reliable PCR/sequencing/ RFLP assay for identification of fungi in onychomycoses. J Med Microbiol 2006;55:1211-6.
20. Nishio K, Kawasaki M, Ishizaki H: Phylogeny of the genera Trichophyton using mitochondrial DNA analysis. Mycopathologia 1992;117:127-32.
21. Faggi E, Pini G, Campisi E, et al: Application of PCR to distinguish common species of dermatophytes. J Clin Microbiol 2001;39:3382-5.
22. Gräser Y, Kuijpers AF, Presber W, de Hoog GS: Molecular taxonomy of the Trichophyton rubrum complex. J Clin Microbiol 2000;38:3329-36.
23. Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC: Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J ClinMicrobiol 2007;45:1200-4.
24. Gutzmer R, Mommert S, Küttler U, Werfel T, Kapp A: Rapid identification and differentiation of fungal DNA in dermatological specimens by LightCycler PCR. J Med Microbiol 2004;53:1207-14.
25. El Fari M, Tietz HJ, Presber W, Sterry W, Gräser Y: Development of an oligonucleotide probe specific for Trichophyton rubrum. Br J Dermatol 1999;141:240-5.
26. Kawasaki M: Verification of a taxonomy of dermatophytes based on mating results and phylogenetic analyses. Med Mycol J 2011;52:291-5.
27. Li HC, Bouchara JP, Hsu MM, Barton R, Chang TC: Identification of dermatophytes by an oligonucleotide array. J Clin Microbiol 2007;45:3160-6.
28. Gräser Y, Fröhlich J, Presber W, de Hoog S: Microsatellite markers reveal geographic population differentiation in Trichophyton rubrum. J Med Microbiol 2007;56:1058-65.
29. Ohst T, de Hoog S, Presber W, Stavrakieva V, Gräser Y: Origins of microsatellite diversity in the Trichophyton rubrum-T. violaceum clade (Dermatophytes). J Clin Microbiol 2004;42:4444-8.
30. de Hoog GS, Gerrits van den Ende AH: Molecular diagnostics of clinical strains of filamentous Basidiomycetes. Mycoses 1998;41:183-9.
31. Kardjeva V, Summerbell R, Kantardjiev T, et al: Forty-eight-hour diagnosis of onychomycosis with subtyping of Trichophyton rubrum strains. J Clin Microbiol 2006;44:1419-27.
32. BLAST. National Center for Biotechnology Information (internette) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
33. Arca E, Saracli MA, Akar A, et al: Polymerase chain reaction in the diagnosis of onychomycosis. Eur J Dermatol 2004;14:52-5.
34. Garg J, Tilak R, Singh S, et al: Evaluation of pan-dermatophyte nested PCR in diagnosis of onychomycosis. J Clin Microbiol 2007;45:3443-5.
35. Berktaş M, Metin A, Bozkurt H, Yavuz MT, Dalkılıç AE: Van ve yöresinde izole edilen dermatofitler. Van Tıp Derg 1995;2:14-9.
36. Lupa S, Seneczko F, Jeske J, Głowacka A, Ochecka-Szymaska A: Epidemiology of dermatomycoses of humans in Central Poland. Mycoses 1999;42:563-5.
37. Özekinci T, Özbek E, Gedik M, et al: Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına başvuran hastalarda dermatofitoz etkenleri. Dic Tıp Derg 2006;33:19-22.
38. Perea S, Ramos MJ, Garau M, et al: Prevalence and risk factors of tinea unguium and tinea pedis in the general population in Spain. J Clin Microbiol 2000;38:3226-30.
39. van Gelderen de Komaid A, Borges de Kestelman I: Urease-positive Trichophyton rubrum strains (previously described as T. raubitschekii): first isolations in Argentina. Eur J Epidemiol 2001;17:929-33.
40. Arabatzis M, Velegraki A, Kantardjiev T, et al: First report on autochthonous urease-positive Trichophyton rubrum (T. raubitschekii) from South-east Europe. Br J Dermatol 2005;153:178-82.
41. Tietz HJ, Hopp M, Gräser Y: First isolation of Trichophyton raubitschekii (syn. T. rubrum) in Europe. Mycoses 2002;45:10-4.
42. Baek SC, Chae HJ, Houh D, Byun DG, Cho BK: Detection and differentiation of causative fungi of onychomycosis using PCR amplification and restriction enzyme analysis. Int J Dermatol 1998;37:682-6.
43. Weitzman I, Salkin IF, Rosenthal SA: Evaluation of trichophyton agars for identification of Trichophyton soudanense. J Clin Microbiol 1983;18:203-5.
44. Gupta AK, Kohli Y, Summerbell RC: Variation in restriction fragment length polymorphisms among serial isolates from patients with Trichophyton rubrum infection. J Clin Microbiol 2001;39:3260-6.
45. Anzawa K, Kawasaki M, Hironaga M, Mochizuki T: Genetic relationship between Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale and Arthroderma vanbreuseghemii. Med Mycol J 2011;52:223-7.
46. Sharma R, Rajak RC, Pandey AK, Gräser Y: Internal Transcribed Spacer (ITS) of rDNA of appendaged and non-appendaged strains of Microsporum gypseum reveals Microsporum appendiculatum as its synonym. Antonie van Leeuwenhoek 2006;89:197-202.

APA	BIYIK F, GRASER Y, SUSEVER S, ÖZARMAĞAN G, YEĞENOĞLU Y (2013). Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. , 26 - 32.
Chicago	BIYIK Fatma,GRASER Yvonne,SUSEVER Serdar,ÖZARMAĞAN Güzin,YEĞENOĞLU Yıldız Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. (2013): 26 - 32.
MLA	BIYIK Fatma,GRASER Yvonne,SUSEVER Serdar,ÖZARMAĞAN Güzin,YEĞENOĞLU Yıldız Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. , 2013, ss.26 - 32.
AMA	BIYIK F,GRASER Y,SUSEVER S,ÖZARMAĞAN G,YEĞENOĞLU Y Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. . 2013; 26 - 32.
Vancouver	BIYIK F,GRASER Y,SUSEVER S,ÖZARMAĞAN G,YEĞENOĞLU Y Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. . 2013; 26 - 32.
IEEE	BIYIK F,GRASER Y,SUSEVER S,ÖZARMAĞAN G,YEĞENOĞLU Y "Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi." , ss.26 - 32, 2013.
ISNAD	BIYIK, Fatma vd. "Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi". (2013), 26-32.

APA	BIYIK F, GRASER Y, SUSEVER S, ÖZARMAĞAN G, YEĞENOĞLU Y (2013). Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. Türkderm-Deri Hastalıkları ve Frengi Arşivi, 47(1), 26 - 32.
Chicago	BIYIK Fatma,GRASER Yvonne,SUSEVER Serdar,ÖZARMAĞAN Güzin,YEĞENOĞLU Yıldız Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. Türkderm-Deri Hastalıkları ve Frengi Arşivi 47, no.1 (2013): 26 - 32.
MLA	BIYIK Fatma,GRASER Yvonne,SUSEVER Serdar,ÖZARMAĞAN Güzin,YEĞENOĞLU Yıldız Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. Türkderm-Deri Hastalıkları ve Frengi Arşivi, vol.47, no.1, 2013, ss.26 - 32.
AMA	BIYIK F,GRASER Y,SUSEVER S,ÖZARMAĞAN G,YEĞENOĞLU Y Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. Türkderm-Deri Hastalıkları ve Frengi Arşivi. 2013; 47(1): 26 - 32.
Vancouver	BIYIK F,GRASER Y,SUSEVER S,ÖZARMAĞAN G,YEĞENOĞLU Y Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi. Türkderm-Deri Hastalıkları ve Frengi Arşivi. 2013; 47(1): 26 - 32.
IEEE	BIYIK F,GRASER Y,SUSEVER S,ÖZARMAĞAN G,YEĞENOĞLU Y "Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi." Türkderm-Deri Hastalıkları ve Frengi Arşivi, 47, ss.26 - 32, 2013.
ISNAD	BIYIK, Fatma vd. "Dermatofitlerin identifikasyonunda moleküler yöntemlerin yeri ve uygulanabilirliğinin belirlenmesi". Türkderm-Deri Hastalıkları ve Frengi Arşivi 47/1 (2013), 26-32.