Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması

Öz:

Dünyada ve ülkemizde Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in neden olduğu sırasıyla kistik ekinokokkoz (KE) ve alveolar ekinokokkoz (AE) önemli helmint hastalıkları arasındadır. Türkiye'de yapılan epidemiyolojik çalışmalar KE prevalansının 291-585/100.000 arasında olduğunu göstermiştir. AE seroprevalansının da %3.5 oranında olduğu bildirilmiştir. KE ve AE tanısında klinik bulgular yanında genelde radyoloji (ultrason, bilgisayarlı tomografi , manyetik rezonans) ve serolojik yöntemler kullanılmaktadır. Kesin tanı patolojik incelemeye dayalıdır. Hidatik kistlerin steril olması ya da protoskoleks içermemesi durumunda ise, patolojik tekniklerle E.granulosus ve E.multilocularis tür ayrımında zorluklar yaşanmaktadır. Bu çalışmada, aynı test içerisinde AE ve KE tanısının yapılmasına imkan verebilecek Echi S (5'-TTTATGAATATTGTGACCCTGAGAT-3') ve Echi A (5'-GGTCTTAACTCAACTCATGGAG-3') primerleri ve üç farklı prob; Anchor Ech (5'-GTTTGCCACCTCGATGTTGACTTAG-fl oresan-3'), Granulosus (5'-LC640-CTAAGGTTTTGGTGTAGTAATTGATATTTT-fosfat-3') ve Multilocularis (5'-LC705CTGTGATCTTGGTGTAGTAGTTGAGATT-fosfat-3') kullanılarak, E.granulosus ve E.multilocularis mitokondriyal 12S rRNA genini hedefl eyen yeni bir multipleks gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (M-RTPCR) yönteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır. M-RT-PCR sırasında, E.granulosus (GenBank: AF297617.1) ve E.multilocularis (GenBank: NC_000928.2) mitokondriyal 12S rRNA gen bölgelerini içeren plazmidler pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. M-RT-PCR yönteminin geliştirilmesinde ayrıca, patolojik olarak KE (n: 10) ve AE (n: 15) olduğu doğrulanmış hastalara ait kist örneklerinin yanı sıra, negatif kontrol olarak sağlıklı insan DNA örnekleri (n: 25) ve 12 farklı parazite (Taenia saginata, Hymenolepis nana, Trichuris trichiura, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jirovecii, Trichomonas vaginalis, Cryptosporidium hominis, Strongyloides stercoralis, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax) ait DNA örnekleri de çalışılmıştır. Testin analitik duyarlılığının saptanması için TOPO klonlama ile E.granulosus ve E.multilocularis pozitif kontrol plazmidleri oluşturulmuştur. Pozitif kontrol plazmidi, analitik duyarlılık ve özgüllüğün belirlenmesi amacıyla her reaksiyonda 106-105-104-103-102-101-1 plazmid kopya olacak şekilde distile su ile sulandırılmıştır. Çalışmamızın sonuçları, testin pozitif kontrol plazmidi kullanılarak elde edilen analitik duyarlılığının, E.granulosus ve E.multilocularis için 1 plazmid kopya/?l örnek olduğunu göstermiştir. Testin 12 farklı parazite ait DNA örneği ile çapraz reaksiyon vermemesi, analitik özgüllüğünü ortaya koymuştur. Yirmibeş hastaya ait kist örneğinde Echinococcus DNA varlığının gösterilmesi ve tür ayrımının yapılabilmesinin yanında, sağlıklı (negatif kontrol) insan DNA örnekleri ile çapraz reaksiyon vermemesi, testin klinik duyarlılık ve özgüllüğünün %100 olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada geliştirilen M-RT-PCR yönteminin, kist örneklerinde ekinokokkoz tanısının konulmasına ek olarak, E.granulosus ve E.multilocularis'in ayırt edilmesinde duyarlı, özgül, hızlı ve güvenilir bir yöntem olduğu tespit edilmiştir

Anahtar Kelime:

Konular: Biyoloji

Detection of Echinococcusgranulosus and Echinococcusmultilocularis in Cyst Samples Using a Novel Single Tube Multiplex Real-Time Polymerase Chain Reaction

Öz:

Cystic echinococcosis (CE) and alveolar echinococcosis (AE) caused by Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis, respectively, are important helminthic diseases worldwide as well as in our country. Epidemiological studies conducted in Turkey showed that the prevalence of CE is 291-585/100.000. It has also been showed that the seroprevalence of AE is 3.5%. For the diagnosis of CE and AE, radiological (ultrasonography, computed tomography, magnetic resonance) and serological methods, in addition to clinical fi ndings, are being used. The defi nitive diagnosis relies on pathological examination When the hydatid cysts are sterile or does not contain protoscolex, problems may occur during pathological discrimination of E.granulosus and E.multilocularis species. In this study, we aimed to develop a novel multiplex real-time polymerase chain reaction (M-RTPCR) targeting mitochondrial 12S rRNA gene of E.granulosus and E.multilocularis using Echi S (5'-TTTATGAATATTGTGACCCTGAGAT-3') and Echi A (5'-GGTCTTAACTCAACTCATGGAG-3') primers and three different probes; Anchor Ech (5'-GTTTGCCACCTCGATGTTGACTTAG-fl uoroscein-3'), Granulosus (5'-LC640-CTAAGGTTTTGGTGTAGTAATTGATATTTT-phosphate-3') and Multilocularis (5'-LC705-CTGTGATCTTGGTGTAGTAGTTGAGATT-phosphate-3') that will enable the diagnosis of CE and AE in same assay. During M-RTR-PCR, plasmids containing E.granulosus (GenBank: AF297617.1) and E.multilocularis (GenBank: NC_000928.2) mitochondrial 12S rRNA regions were used as positive controls. Cysts samples of patients which were pathologically confi rmed to be CE (n: 10) and AE (n: 15) and healthy human DNA samples (n: 25) as negative control as well as DNA samples of 12 different parasites (Taenia saginata, Hymenolepis nana, Trichuris trichiura, Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis jirovecii, Trichomonas vaginalis, Cryptosporidium hominis, Strongyloides stercoralis, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax) were used to develop M-RT-PCR. E.granulosus and E.multilocularis control plasmids were constructed to detect analytic sensitivity of the test using TOPO cloning. Positive control plasmids were diluted to determine analytical sensitivity and specifi city by distilled water at 106-105-104-103-102-101-1 plasmid copy of dilution in each reaction. According to the results, analytical sensitivity of the assay for E.granulosus and E.multilocularis was 1 copy plasmid/?l reaction. The non-existence of cross reactivity with 12 different parasites' DNA samples showed the analytical specifi city of the assay. Displaying Echinococcus DNA in cyst samples among 25 patients and species discrimination as well as non-existence of cross reactivity with human DNA samples showed that the clinical sensitivity and specifi city of the assay were 100%. As a result, the M-RT-PCR developed in the present study provided a sensitive, specifi c, rapid, and reliable method in the diagnosis of echinococcosis and the discrimination of E.granulosus and E.multilocularis from cyst samples

Anahtar Kelime:

Konular: Biyoloji

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Bibliyografik

Nakao M, Lavikainen A, Yanagida T, Ito A. Phylogenetic systematics of the genus Echinococcus (Cestoda: Taeniidae). Int J Parasitol 2013; 43(12-13): 1017-29.
Ma J, Wang H, Lin G, et al. Molecular identifi cation of Echinococcus species from eastern and southern Qinghai, China, based on the mitochondrial cox1 gene. Parasitol Res 2012; 111(1): 179-84.
Zhang T, Yang D, Zeng Z, et al. Genetic characterization of human-derived hydatid cysts of Echinococcus granulosus sensu lato in Heilongjiang Province and the fi rst report of G7 genotype of E. canadensis in humans in China. PLoS One 2014; 9(10): e109059.
Altıntas N, Öztatlıcı M, Altıntas N, Ünver A, Sakarya A. Molecular analysis of cattle isolates of Echinococcus granulosus in Manisa Province of Turkey. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2013; 19(3): 455-9.
Liu CN, Lou ZZ, Li L, et al. Discrimination between E. granulosus sensu stricto, E. multilocularis and E. shiquicus using a multiplex PCR assay. PLoS Negl Trop Dis 2015; 9(9): e0004084.
Utuk AE, Simsek S, Koroglu E, McManus DP. Molecular genetic characterization of different isolates of Echinococcus granulosus in east and southeast regions of Turkey. Acta Trop 2008; 107(2): 192-4.
Altintas N. Past to present: echinococcosis in Turkey. Acta Trop 2003; 85(2): 105-12.
Merdivenci A, Aydınlıoğlu K. Hydatidosis (Hydatid Disease). Istanbul University, Cerrahpasa School of Medicine Publications, vol. 2972. 1982, Istanbul.
Snábel V, Altintas N, D'Amelio S, et al. Cystic echinococcosis in Turkey: genetic variability and fi rst record of the pig strain (G7) in the country. Parasitol Res 2009; 105(1): 145-54.
Miman O, Yazar S. Alveolar echinococcosis in Turkey: in the light of the literature. Turkiye Parazitol Derg 2012; 36(2): 116-20.
Merdivenci, A. Türkiye'de tilkide Alveococcus multilocularis olgusu ve yurdumuzda Alveococcus (alveolar kist)'in epidemiyolojisi ve epizootolojisi. Turk Hidatid Derg 1965; 1: 6-29.
Kilimcioğlu AA, Girginkardeşler N, Korkmaz M, et al. A mass screening survey of cystic echinococcosis by ultrasonography, Western blotting, and ELISA among university students in Manisa, Turkey. Acta Trop 2013; 128(3): 578-83.
Pektaş B, Altıntaş N, Akpolat N, Gottstein B. Evaluation of the diagnostic value of the ELISA tests developed by using EgHF, Em2 and EmII/3-10 antigens in the serological diagnosis of alveolar echinococcosis. Mikrobiyol Bul 2014; 48(3): 461-8.
Güreser AS, Özcan O, Özünel L, Boyacıoğlu Zİ, Taylan Özkan A. Evaluation of the radiological, biochemical and serological parameters of patients prediagnosed as cystic echinococcosis in Çorum, Turkey. Mikrobiyol Bul 2015; 49(2): 231-9.
Korkmaz M, Inceboz T, Celebi F, Babaoglu A, Uner A. Use of two sensitive and specifi c immunoblot markers, em70 and em90, for diagnosis of alveolar echinococcosis. J Clin Microbiol 2004; 42(7): 3350-2.
Schneider R, Gollackner B, Edel B, et al. Development of a new PCR protocol for the detection of species and genotypes (strains) of Echinococcus in formalin-fi xed, paraffi n-embedded tissues. Int J Parasitol 2008; 38(8-9): 1065-71.
Georges S, Villard O, Filisetti D, et al. Usefulness of PCR analysis for diagnosis of alveolar echinococcosis with unusual localizations: two case studies. J Clin Microbiol 2004; 42(12): 5954-6.
Dinkel A, Kern S, Brinker A, et al. A real-time multiplex-nested PCR system for coprological diagnosis of Echinococcus multilocularis and host species. Parasitol Res 2011; 109(2): 493-8.
Dybicz M, Gierczak A, Dabrowska J, Rdzanek L, Michalowicz B. Molecular diagnosis of cystic echinococcosis in humans from central Poland. Parasitol Int 2013; 62(4): 364-7.
Grenouillet F, Frider B, Alvarez Rodriguez J, et al. Molecular diagnosis of polycystic echinococcosis due to Echinococcus vogeli in a Paraguayan immigrant in Argentina. J Clin Microbiol 2013; 51(9): 3151-3.
Arcenas RC, Uhl JR, Buckwalter SP, et al. A real-time polymerase chain reaction assay for detection of Pneumocystis from bronchoalveolar lavage fl uid. Diagn Microbiol Infect Dis. 2006; 54(3): 169-75.
Stefanic S, Shaikenov BS, Deplazes P, Dinkel A, Torgerson PR, Mathis A. Polymerase chain reaction for detection of patent infections of Echinococcus granulosus ("sheep strain") in naturally infected dogs. Parasitol Res 2004; 92(4): 347-51.
Döskaya M, Caner A, Degirmenci A, et al. Degree and frequency of inhibition in a routine real-time PCR detecting Pneumocystis jirovecii for the diagnosis of Pneumocystis pneumonia in Turkey. J Med Microbiol 2011; 60(Pt 7): 937-44.
Oines O, Isaksson M, Hagström Å, Tavornpanich S, Davidson RK. Laboratory assessment of sensitive molecular tools for detection of low levels of Echinococcus multilocularis-eggs in fox (Vulpes vulpes) faeces. Parasit Vectors 2014; 7: 246.
Şakalar Ç, Kuk S, Erensoy A, et al. Molecular discrimination of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis by sequencing and a new PCR-RFLP method with the potential use for other Echinococcus species. Turk J Med Sci 2014; 44(5): 741-8.
Chaya D, Parija SC. Performance of polymerase chain reaction for the diagnosis of cystic echinococcosis using serum, urine, and cyst fl uid samples. Trop Parasitol 2014; 4(1): 43-6.

APA	CAN H, İNCEBOZ T, CANER A, ATALAY ŞAHAR E, KARAKAVUK M, Doskaya M, Çelebi F, DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA A, Gulce Iz S, Gürüz A, KORKMAZ M (2016). Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. , 266 - 277.
Chicago	CAN Hüseyin Can,İNCEBOZ Tonay,CANER Ayşe,ATALAY ŞAHAR Esra,KARAKAVUK Muhammet,Doskaya Mert,Çelebi Fehmi,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA Aysu,Gulce Iz Sultan,Gürüz Adnan Yüksel,KORKMAZ Metin Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. (2016): 266 - 277.
MLA	CAN Hüseyin Can,İNCEBOZ Tonay,CANER Ayşe,ATALAY ŞAHAR Esra,KARAKAVUK Muhammet,Doskaya Mert,Çelebi Fehmi,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA Aysu,Gulce Iz Sultan,Gürüz Adnan Yüksel,KORKMAZ Metin Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. , 2016, ss.266 - 277.
AMA	CAN H,İNCEBOZ T,CANER A,ATALAY ŞAHAR E,KARAKAVUK M,Doskaya M,Çelebi F,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA A,Gulce Iz S,Gürüz A,KORKMAZ M Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. . 2016; 266 - 277.
Vancouver	CAN H,İNCEBOZ T,CANER A,ATALAY ŞAHAR E,KARAKAVUK M,Doskaya M,Çelebi F,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA A,Gulce Iz S,Gürüz A,KORKMAZ M Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. . 2016; 266 - 277.
IEEE	CAN H,İNCEBOZ T,CANER A,ATALAY ŞAHAR E,KARAKAVUK M,Doskaya M,Çelebi F,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA A,Gulce Iz S,Gürüz A,KORKMAZ M "Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması." , ss.266 - 277, 2016.
ISNAD	CAN, Hüseyin Can vd. "Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması". (2016), 266-277.

APA	CAN H, İNCEBOZ T, CANER A, ATALAY ŞAHAR E, KARAKAVUK M, Doskaya M, Çelebi F, DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA A, Gulce Iz S, Gürüz A, KORKMAZ M (2016). Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. Mikrobiyoloji Bülteni, 50(2), 266 - 277.
Chicago	CAN Hüseyin Can,İNCEBOZ Tonay,CANER Ayşe,ATALAY ŞAHAR Esra,KARAKAVUK Muhammet,Doskaya Mert,Çelebi Fehmi,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA Aysu,Gulce Iz Sultan,Gürüz Adnan Yüksel,KORKMAZ Metin Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. Mikrobiyoloji Bülteni 50, no.2 (2016): 266 - 277.
MLA	CAN Hüseyin Can,İNCEBOZ Tonay,CANER Ayşe,ATALAY ŞAHAR Esra,KARAKAVUK Muhammet,Doskaya Mert,Çelebi Fehmi,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA Aysu,Gulce Iz Sultan,Gürüz Adnan Yüksel,KORKMAZ Metin Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. Mikrobiyoloji Bülteni, vol.50, no.2, 2016, ss.266 - 277.
AMA	CAN H,İNCEBOZ T,CANER A,ATALAY ŞAHAR E,KARAKAVUK M,Doskaya M,Çelebi F,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA A,Gulce Iz S,Gürüz A,KORKMAZ M Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2016; 50(2): 266 - 277.
Vancouver	CAN H,İNCEBOZ T,CANER A,ATALAY ŞAHAR E,KARAKAVUK M,Doskaya M,Çelebi F,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA A,Gulce Iz S,Gürüz A,KORKMAZ M Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2016; 50(2): 266 - 277.
IEEE	CAN H,İNCEBOZ T,CANER A,ATALAY ŞAHAR E,KARAKAVUK M,Doskaya M,Çelebi F,DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA A,Gulce Iz S,Gürüz A,KORKMAZ M "Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması." Mikrobiyoloji Bülteni, 50, ss.266 - 277, 2016.
ISNAD	CAN, Hüseyin Can vd. "Kist Örneklerinde Yeni Bir Tek Tüp Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Echinococcus granulosus ve Echinococcus multilocularis'in Saptanması". Mikrobiyoloji Bülteni 50/2 (2016), 266-277.