BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması

ASLAN, GÖNÜL; AYDIN, Esin; EMEKDAŞ, Gürol; ÖZKUL, Yusuf; FIANDACA, J. Mark; STENDER, Henrik; LEE, M. Natuschka; Börekçi, Gülay

BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması

Gülay BÖREKÇİ, (Mersin Üniversitesi, Sağlık Yüksekokulu, Mersin, Türkiye)

Gönül ASLAN, (Mersin Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Mersin, Türkiye)

Esin AYDIN, (Mersin Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Mersin, Türkiye)

J. Mark FIANDACA, (AdvanDx Inc. Firması, Woburn, Massachusetts, ABD)

Henrik STENDER, (AdvanDx Inc. Firması, Woburn, Massachusetts, ABD)

M. Natuschka LEE, (Münih Teknik Üniversitesi, Mikrobiyoloji Bölümü, Freising, Almanya)

Yusuf ÖZKUL, (Erciyes Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik Anabilim Dalı, Kayseri, Türkiye)

Gürol EMEKDAŞ (Mersin Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Mersin, Türkiye)

Mikrobiyoloji Bülteni

1 0

Yıl: 2014 Cilt: 48 Sayı: 3 Sayfa Aralığı: 385 - 401 Metin Dili: Türkçe İndeks Tarihi: 29-07-2022

BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması

Öz:

Mikobakterilerin hızlı ve doğru tanısı, günümüzde halen ciddi bir halk sağlığı sorunu olan tüberkülo- zun önlenmesi ve hastaların etkin tedavisi için önem taşımaktadır. Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemi, rRNA’yı hedef alan problar kullanılarak direkt klinik örnekler ve kültürlerden, karışık ortamdaki mikroorganizmaların birkaç saat içinde kesin ve doğru tanımlanmasına olanak sağlamaktadır. Bu çalış- mada, BACTEC MGITTM (Mycobacteria Growth Indicator Tube) pozitif kültürlerden mikobakteri türle- rinin tanımlanması için iki farklı FISH (Oligo-FISH ve PNA-FISH) yönteminin konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırılarak rutin laboratuvar kullanımındaki tanısal performansının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, 60 MGIT (BD, ABD) pozitif ve 52 MGIT negatif kültür ile 10 farklı referans suş dahil edilmiş- tir. Oligo-FISH yönteminde, 16S rRNA’yı hedef alan oligonükleotid problar (Myc657: Mycobacterium subdivision, Eub338: Pozitif kontrol, NonEub: Negatif kontrol); PNA-FISH yönteminde ise 16S rRNA’yı hedef alan peptid nükleik asit problar (MTC: Mycobacterium tuberculosis kompleks, NTM: Tüberküloz dışı mikobakteri, BacUni: Pozitif kontrol) kullanılmıştır. Konvansiyonel yöntemler olarak, MGIT 960 kültür sis- teminin yanı sıra Ehrlich-Ziehl-Neelsen boyama (ARB) ve Löwenstein-Jensen (LJ) besiyerinde kültür yön- temleri uygulanmıştır. Çalışmaya alınan MGIT pozitif 60 (44 balgam, 4 doku, 4 idrar, 3 bronkoalveoler lavaj, 3 BOS, 1 apse, 1 periton sıvısı) kültürden 29 (%48.3)’u ARB ile, 44 (%73.3)’ü LJ kültür yöntemi ile olmak üzere toplam 59’u pozitif sonuç vermiş; bunların 58 (%96.6)’i MTC, 1 (%1.7)’i ise NTM olarak tiplendirilmiştir. Oligo-FISH ile izolatların %95 (57/60)’i Mycobacterium spp. olarak saptanırken, 3 (%5)‘ü negatif bulunmuştur. PNA-FISH ile 54 (%91.5) izolat mikobakteri olarak saptanmış ve bu izolatlardan 53 (%90)’ü MTC, 1 (%1.7)’i NTM olarak tiplendirilmiştir. Oligo-FISH ile pozitif, PNA-FISH ile negatif sonuç veren beş izolatın tanımlanmasında ise, PNA-FISH yönteminde yapılan minör modifikasyon ile pozitif sonuç elde edilmiştir. Oligo- ve PNA-FISH yöntemlerinin, MGIT pozitif kültürlerden mikobakterileri tanımlama süresi konvansiyonel yöntemlere göre daha kısa olup (2-2.5 saat), her iki FISH yönteminin konvansiyonel yöntemlere göre, PNA-FISH yönteminin de Oligo-FISH’e göre daha pratik olduğu sap- tanmıştır. Oligo-FISH yönteminin duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif prediktif değeri sırasıyla, %96.6, %100, %100 ve %96.4 olarak belirlenmiş; bu değerler PNA-FISH için sırasıyla, %91.5, %100, %100 ve %91.4 olarak bulunmuştur (p< 0.0001). Yöntemlerin uyumluluğu kappa istatistiksel analizi kullanılarak belirlenmiş; her iki FISH yöntemi arasında ve her ikisi ile konvansiyonel yöntemler arasında mükemmel uyumluluk saptanmıştır (κ: 0.964, 0.929, 0.964; p= 0.001).

Anahtar Kelime:

Konular: Mikroskopi Biyoloji Mikrobiyoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji

Identification of Mycobacterium species from BACTEC MGITTM positive cultures with oligo-FISH and PNA-FISH methods

Öz:

Rapid and accurate diagnosis of mycobacteria is very important in the prevention and effective treatment of tuberculosis which is still a serious public health problem. Fluorescence in situ hybridiza- tion (FISH) method using rRNA targeted probes allows for precise and accurate identification of mixed microorganisms from cultures and directly from clinical samples within a few hours without the need for culture methods. In this study it was aimed to compare the diagnostic performance of two different FISH methods (Oligo-FISH and PNA-FISH) with the conventional culture methods for the identification of Mycobacterium spp. grown in BACTEC MGITTM (Mycobacteria Growth Indicator Tube) system. A total of 60 MGIT (BD, USA) positive, 52 MGIT negative samples and 10 different reference strains were included in the study. 16S rRNA targeted oligonucleotide probes (Myc657: Mycobacterium subdivision, Eub338: Positive control, NonEub: Negative control) were used for oligo-FISH, and 16S rRNA targeted peptide nucleotide probes (MTC: Mycobacterium tuberculosis complex, NTM: Non-tuberculosis Mycobacterium, BacUni: Positive control) for PNA-FISH. Ehrlich-Ziehl-Neelsen staining (ARB) and Löwenstein-Jensen (LJ) culture methods were performed as conventional methods as well as MGIT 960 culture system. Of MGIT positive 60 samples (44 sputum, 4 tissue, 4 urine, 3 bronchoalveolar lavage, 3 CSF, 1 abscess, 1 peritoneal fluid), 29 (48.3%) were found positive for ARB and 44 (73.3%) with LJ culture methods giving a total of 59 positive results. Fifty-eight (96.6%) of those isolates were identified as MTC, and one (1.7%) as NTM by conventional methods. By using Oligo-FISH, 95% (57/60) of the isolates were identified as Mycobacterium spp., while three samples (5%) yielded negative result. By using PNA-FISH, 54 (91.5%) isolates were identified as mycobacteria, of them 53 (90%) were typed as MTC and 1 (1.7%) as NTM. Five isolates that were found positive with Oligo-FISH, but negative with PNA-FISH, yielded positive result with PNA-FISH method performed with minor modifications. It was determined that both FISH methods are more rapid (approximately 2-2.5 hours) and practical than the conventional culture methods and also PNA-FISH was more practical than Oligo-FISH. The sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the probes used for Oligo-FISH, were 96.6%, 100%, 100% and 96.4%, respectively. Those values for the probes used for PNA-FISH, were 91.5%, 100%, 100% and 91.4%, respectively (p< 0.0001).

Anahtar Kelime:

Konular: Mikroskopi Biyoloji Mikrobiyoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Bibliyografik

1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2013. Available at: http://apps.who.int/iris/bitstre- am/10665/91355/1/9789241564656_eng.pdf
2. Tille PM (ed). Mycobacteria, pp: 484-510. In: Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. 2013, 13th ed. Elsevier, Mosby, St.Louis.
3. Palomino JC. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field. Eur Respir J 2005; 26(2): 339-50.
4. Çetin ES, Aynali A, Öztürk Tuba, Özseven AG, Kaya S. Mikobakterilerin klinik ömeklerden izolasyonunda Löwenstein-Jensen besiyeri kültürü ve Bactec Mycobacterium Growth Indicator Tube 960 sisteminin değerlendirilmesi. S.D.Ü. Tıp Fak Derg 2012; 19(1): 12-6.
5. Neonakis IK, Gitti Z, Krambovitis E, Spandidos DA. Molecular diagnostic tools in mycobacteriology. J Microbiol Methods 2008; 75(1): 1-11.
6. Soini H, Musser JM. Molecular diagnosis of mycobacteria. Clin Chem 2001; 47(5): 809-14.
7. Wolff A, Perch-Nielsen IR, Poulsen CR, El-Ali J, Bang DD. Removal of PCR inhibitors using dielectrophoresis for sample preparation in a microfabricated system. 7th International Conference on Miniaturized Chemical and Biological Analysis Systems. October 5-9, 2003, Squaw Valley, California. Conference Book, p: 1137-40.
8. Fredricks DN, Relman DA. Improved amplification of microbial DNA from blood cultures by removal of the PCR inhibitor sodium polyanetholesulfonate. J Clin Microbiol 1998; 36(10): 2810-6.
9. Amann R, Fuchs BM. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nat Rev Microbiol 2008; 6(5): 340-8.
10. Volpi EV, Bridger JM. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. Biotech- niques 2008; 45(4): 385-409.
11. Stender H, Fiandaca M, Hyldig-Nielsen JJ, Coull J. PNA for rapid microbiology. J Microbiol Methods 2002; 48(1): 1-17.
12. St. Amand AL, Frank DN, De Groote MA, Basaraba RJ, Orme IM, Pace NR. Use of specific rRNA oligonucle- otide probes for microscopic detection of Mycobacterium tuberculosis in culture and tissue specimens. J Clin Microbiol 2005; 43(10): 5369-71.
13. Davenport RJ, Curtis TP, Goodfellow M, Stainsby FM, Bingley M. Quantitative use of fluorescent in situ hybridization to examine relationships between mycolic acid-containing Actinomycetes and foaming in activated sludge plants. Appl Environ Microbiol 2000; 66(3): 1158-66.
14. Drobniewski FA, More PG, Haris GS. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacterial liquid cultures by using peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization probes. J Clin Microbiol 2000; 38(1): 444-7.
15. Hongmanee P, Stender H, Rasmussen OF. Evaluation of a fluorescence in situ hybridization assay for differentiation between tuberculous and nontuberculous Mycobacterium species in smears of Lowenstein-Jensen and Mycobacteria Growth Indicator Tube cultures using peptide nucleic acid probes. J Clin Microbiol 2001; 39(3): 1032-5.
16. Lefmann M, Schweickert B, Buchholz P, et al. Evaluation of peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization for identification of clinically relevant mycobacteria in clinical specimens and tissue sections. J Clin Microbiol 2006; 44(10): 3760-7.
17. Selvaraju SB, Kapoor R, Yadav JS. Peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization (PNA-FISH) assay for specific detection of Mycobacterium immunogenum and DNA-FISH assay for analysis of pseudomonads in metalworking fluids and sputum. Mol Cell Probes 2008; 22(5-6): 273-80.
18. Moter A, Göbel UB. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J Microbiol Methods 2000; 41(2): 85-112.
19. Stender H, Mollerup TA, Lund K, Petersen KH, Hongmanee P, Godtfredsen SE. Direct detection and identification of Mycobacterium tuberculosis in smear-positive sputum samples by fluorescence in situ hybridization (FISH) using peptide nucleic acid (PNA) probes. Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3(9): 830-7.
20. De Los Reyes FL, Ritter W, Raskin L. Group-specific small-subunit rRNA hybridization probes to characterize filamentous foaming in activated sludge systems. Appl Environ Microbiol 1997; 63(3): 1107-17.
21. Schuppler M, Wagner M, Schön G, Göbel U. In situ identification of nocardioform actinomycetes in activa- ted sludge using fluorescent rRNA-targeted oligonucleotide probes. Microbiology 1998; 144(1): 249-59.
22. Amann RI, Binder BJ, Olson RJ, Chisholm SW, Devereux R, Stahl DA. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl Environ Microbiol 1990; 56(6): 1919-25.
23. Wallner G, Amann R, Beisker W. Optimizing fluorescent in situ hybridization with rRNA-targeted oligonuc- leotide probes for flow cytometric identification of microorganisms. Cytometry 1993; 14(2): 136-43.
24. Amann RI. In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization with rRNA-targeted nucleic acid probes, pp: 1-15. In: Akkermans ADL, van Elsas JD, De Bruijn FJ (eds), Molecular Microbial Ecology Manual 3.3.6. 1995. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.
25. Lawrence JB, Singer RH. Quantitative analysis of in situ hybridization methods for the detection of actin gene expression. Nucleic Acids Res 1985; 13(5): 1777-99.
26. Lee LV. Procedures for Identification From Culture: Mycobacteriology and Antimycobacterial Susceptibility Testing, pp: 7.6.1.1-12. In: Isenberg HD (ed), Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2004. ASM Press, Washington, DC.
27. Weitzman I. Acid-Fast Stains: Mycobacteriology and Antimycobacterial Susceptibility Testing, pp: 7.2.1.1-4. In: Isenberg HD (ed), Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2004. ASM Press, Washington, DC.
28. Özakın C, Gedikoğlu S. Tüberküloz Tanısında Tüberküloz Laboratuvarının Rolü: Tanı ve İlaç Duyarlılık Testlerinde Rutin Laboratuvar Yöntemlerinin Değeri. 21. Yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu ve II. Tüberküloz Laboratuvar Tanı Yöntemleri Kursu. 11-12 Haziran 2003, Samsun. Kurs Kitabı, s: 397-401.
29. Stender H, Lund K, Petersen KH, et al. Fluorescence in situ hybridization assay using peptide nucleic acid probes for differentiation between tuberculous and nontuberculous mycobacterium species in smears of mycobacterium cultures. J Clin Microbiol 1999; 37(9): 2760-5.
30. Tomiyasu I. Mycolic acid composition and thermally adaptive changes in Nocardia asteroides. J Bacteriol 1982; 151(2): 828-37.
31. Carr EL, Eales K, Soddell J, Seviour RJ. Improved permeabilization protocols for fluorescence in situ hybridization (FISH) of mycolic-acid-containing bacteria found in foams. J Microbiol Methods 2005; 61(1): 47-54.
32. Macnaughton SJ, O’Donnell AG, Embley TM. Permeabilization of mycolic-acid-containing actinomycetes for in situ hybridization with fluorescently labelled oligonucleotide probes. Microbiology 1994; 140(Pt 10): 2859-65.
33. Rodriguez-Nuñez J, Avelar FJ, Marquez F, Rivas-Santiago B, Quiñones C, Guerrero-Barrera AL. Mycobacterium tuberculosis complex detected by modified fluorescent in situ hybridization in lymph nodes of clinical samples. J Infect Dev Ctries 2012; 6(1): 58-66.

APA	Börekçi G, ASLAN G, AYDIN E, FIANDACA J, STENDER H, LEE M, ÖZKUL Y, EMEKDAŞ G (2014). BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. , 385 - 401.
Chicago	Börekçi Gülay,ASLAN GÖNÜL,AYDIN Esin,FIANDACA J. Mark,STENDER Henrik,LEE M. Natuschka,ÖZKUL Yusuf,EMEKDAŞ Gürol BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. (2014): 385 - 401.
MLA	Börekçi Gülay,ASLAN GÖNÜL,AYDIN Esin,FIANDACA J. Mark,STENDER Henrik,LEE M. Natuschka,ÖZKUL Yusuf,EMEKDAŞ Gürol BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. , 2014, ss.385 - 401.
AMA	Börekçi G,ASLAN G,AYDIN E,FIANDACA J,STENDER H,LEE M,ÖZKUL Y,EMEKDAŞ G BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. . 2014; 385 - 401.
Vancouver	Börekçi G,ASLAN G,AYDIN E,FIANDACA J,STENDER H,LEE M,ÖZKUL Y,EMEKDAŞ G BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. . 2014; 385 - 401.
IEEE	Börekçi G,ASLAN G,AYDIN E,FIANDACA J,STENDER H,LEE M,ÖZKUL Y,EMEKDAŞ G "BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması." , ss.385 - 401, 2014.
ISNAD	Börekçi, Gülay vd. "BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması". (2014), 385-401.

APA	Börekçi G, ASLAN G, AYDIN E, FIANDACA J, STENDER H, LEE M, ÖZKUL Y, EMEKDAŞ G (2014). BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. Mikrobiyoloji Bülteni, 48(3), 385 - 401.
Chicago	Börekçi Gülay,ASLAN GÖNÜL,AYDIN Esin,FIANDACA J. Mark,STENDER Henrik,LEE M. Natuschka,ÖZKUL Yusuf,EMEKDAŞ Gürol BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. Mikrobiyoloji Bülteni 48, no.3 (2014): 385 - 401.
MLA	Börekçi Gülay,ASLAN GÖNÜL,AYDIN Esin,FIANDACA J. Mark,STENDER Henrik,LEE M. Natuschka,ÖZKUL Yusuf,EMEKDAŞ Gürol BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. Mikrobiyoloji Bülteni, vol.48, no.3, 2014, ss.385 - 401.
AMA	Börekçi G,ASLAN G,AYDIN E,FIANDACA J,STENDER H,LEE M,ÖZKUL Y,EMEKDAŞ G BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2014; 48(3): 385 - 401.
Vancouver	Börekçi G,ASLAN G,AYDIN E,FIANDACA J,STENDER H,LEE M,ÖZKUL Y,EMEKDAŞ G BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2014; 48(3): 385 - 401.
IEEE	Börekçi G,ASLAN G,AYDIN E,FIANDACA J,STENDER H,LEE M,ÖZKUL Y,EMEKDAŞ G "BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması." Mikrobiyoloji Bülteni, 48, ss.385 - 401, 2014.
ISNAD	Börekçi, Gülay vd. "BACTEC MGITTM pozitif kültürlerden Mycobacterium türlerinin oligo-FISH ve PNA-FISH yöntemleriyle tanımlanması". Mikrobiyoloji Bülteni 48/3 (2014), 385-401.