Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi

KALIN, Recep; Acik, Mehmet Nuri; CETINKAYA, BURHAN; TAŞDEMİR, Bülent; karahan, murat

Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi

Recep KALIN, (Cumhuriyet University)

Murat KARAHAN, (Cumhuriyet University)

MEHMET NURİ AÇIK, (Bingol University)

Bülent TAŞDEMİR, (Veterinary Control Institute)

Burhan ÇETİNKAYA (Firat University)

Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi

10 3

Yıl: 2017 Cilt: 23 Sayı: 6 Sayfa Aralığı: 925 - 931 Metin Dili: Türkçe İndeks Tarihi: 29-07-2022

Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi

Öz:

Bu çalışmanın amacı, inek sütlerinde major mastitis patojenlerinin (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli ve Mycoplasma bovis) saptanabilmesi için hızlı, basit ve spesifik bir DNA ekstraksiyon ve multipleks PCR yöntemi geliştirmektir. Kaliforniya mastitis testi (CMT) pozitif 200 süt örneğinin kültürü sonrasında S. aureus, S. agalactiae ve E. coli varlığı sırasıyla 45 (%22.5), 21 (%10.5) ve 11 (%5.5) örnekte saptandı. Çalışmada optimizasyonu yapılan DNA ekstraksiyon metodu ile elde edilen DNA örneklerinin mPCR analizi neticesinde S. aureus, S. agalactiae ve E. coli varlığı sırasıyla %26.5 (53/200), %12 (24/200) ve %6 (12/200) olarak belirlendi. Ticari DNA izolasyon kitiyle elde edilen DNA örneklerinde de yukarıdaki etkenlerin varlığı benzer oranda bulundu. Öte yandan süt örneklerinin hiçbirinde kültür veya mPCR ile M. bovis tespit edilmedi. Kültür ve mPCR sonuçları arasındaki fark istatistiki olarak önemli bulundu (P<0.001). Kültür sonuçları referens olarak kabul edildiğinde, optimize edilen mPCR'ın sensitivitesi ve spesifisitesi sırasıyla %100 ve %89.2 olarak hesaplandı. Bu sonuçlara göre; çalışmada kullanılan mPCR yöntemi sığır süt örneklerinde majör mastitis etkenlerinin hızlı, duyarlı, spesifik ve eş zamanlı tespit edilmesinde alternatif rutin teşhis metodu olarak kullanılabilir.

Anahtar Kelime:

Konular: Mikrobiyoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji Veterinerlik

Development of A Multiplex PCR Method for Direct Detection of Common Mastitis Pathogens in Bovine Milk Samples

Öz:

The aim of this study was to evaluate a simple and rapid DNA extraction method combined with a multiplex polymerase chain reaction (mPCR) for the identification of the major mastitis pathogens (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli and Mycoplasma bovis) from milk samples. Of the 200 California Mastitis Test (CMT) positive milk samples, 45 (22.5%), 21 (10.5%) and 11 (5.5%) were detected as positive for the presence of S. aureus, S. agalactiae and E. coli by culture, respectively. In mPCR by DNA isolation method optimised here, S. aureus, S. agalactiae and E. coli were detected in 26.5% (53/200), 12% (24/200) and 6% (12/200) of the milk samples, respectively. The abovementioned agents were observed in similar proportions when the samples were analysed by a commercial DNA isolation kit. On the other hand, M. bovis was not detected in any of the milk samples by either culture or mPCR methods. A significant difference was determined between the results of culture and mPCRs (P<0.001). Diagnostic sensitivity and specificity of the optimised mPCR were calculated as 100% and 89.2% respectively, when culture results were considered as reference. The results suggest that the mPCR assay employed in this study could be used as an alternative routine diagnostic method for rapid, sensitive, and speciŞc simultaneous detection of major mastitis agents in bovine milk samples.

Anahtar Kelime:

Konular: Mikrobiyoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji Veterinerlik

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Erişime Açık

1. Schalm OW, Carroll EJ, Jain NC: Bovine mastitis. Lea and Febiger, Philadelphia, PA; 1971.
2. Jain NC: Common mammary pathogens and factors in infection and mastitis. J Dairy Sci, 62, 128-134, 1979. DOI: 10.3168/jds.S0022- 0302(79)83214-2
3. DeGraves FJ, Fetrow J: Economics of mastitis and mastitis control. Vet Clin North Am: Food Anim Pract, 9, 421-434, 1993. DOI: 10.1016/S0749- 0720(15)30611-3
4. Osteras O: The cost of mastitis: an opportunity to gain more money. Proc. British Mastitis Conf. Shepton Mallet, 67-77, 2000.
5. Amin AS, Hamouda RH, Abeer AA Abdel-All: PCR assays for detecting major pathogens of mastitis in milk samples. World J. Dairy & Food Sci, 6 (2): 199-206, 2011.
6. Barkema HW, Schukken YH, Zadoks RN: The role of cow, pathogen, and treatment regimen in the therapeutic success of bovine Staphylococcus aureus mastitis. J Dairy Sci, 89, 1877-1895, 2006. DOI: 10.3168/jds.S0022- 0302(06)72256-1
7. Blood DC, Henderson JA, Radostits OM: A Textbook of the diseases of cattle, sheep, pigs and horses. In, Veterinary Medicine. Bailliere Tindall, London, 1979.
8. Bradley AJ, Leach KA, Breen JE, Green LE, Green MJ: Survey of the incidence and aetiology of mastitis on dairy farms in England and Wales. Vet Rec, 160, 253-258, 2007. DOI: 10.1136/vr.160.8.253
9. Bramley AJ, Cullor JS, Erskine RJ, Fox LK, Harmon RJ, Hogan JS, Nickerson SC, Oliver SP, Smith KL, Sordillo LM: Current Concepts of bovine mastitis, 4th edn. National Mastitis Council, Inc, Madison, WI, 1996.
10. Constable P, Pyörälä S, Smith G: Guidelines for antimicrobial use in cattle. In, Guardabassi L, Jensen LB, Kruse H (Eds): Guide to antimicrobial use in animals. Blackwell Publishing Ltd., Oxford, UK. 143-160, 2008.
11. Cremonesi P, Castiglioni B, Malferrari G, Biunno I, Vimercati C, Moroni P, Morandi S, Luzzana M: Technical Note: Improved method for rapid DNA extraction of mastitis pathogens directly from milk. J Dairy Sci, 89 (1): 163-169, 2006. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(06)72080-X
12. Kenar B, Bagcigil AF, Kuyucuoglu Y, Kahraman BB, Konak S: Antimicrobial susceptibility profiles and coagulase gene polymorphism of Staphylococcus aureus isolated from bovine subclinical mastitis. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 23 (4): 535-540, 2017. DOI: 10.9775/kvfd.2016.17247
13. Foddai A, Idini G, Fusco M, Rosa N, De La Fe C, Zinellu S, Corona L, Tola S: Rapid differential diagnosis of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis based on a multiplex-PCR and A PCR-RFLP. Mol Cell Probes, 19, 207-212, 2005. DOI: 10.1016/j.mcp.2004.11.007
14. Fox LK, Kirk JH, Britten A: Mycoplasma mastitis: A review of transmission and control. J Vet Med B, 52, 153-160, 2005. DOI: 10.1111/ j.1439-0450.2005.00845.x
15. Gonzalez RN, Wilson DJ: Mycoplasma mastitis in dairy herds. Vet Clin North Am: Food Anim Pract, 19, 199-221, 2003. DOI: 10.1016/S0749- 0720(02)00076-2
16. Hadimli HH, Erganiş O: Mastitis ve bağışıklık. Veterinarium, 13 (1): 37-42, 2001.
17. Halasa T, Huijps K, Østerås O, Hogeveen H: Economic effects of bovine mastitis and mastitis management. Vet Q, 29, 18-31, 2007. DOI: 10.1080/01652176.2007.9695224
18. Hirose K, Kawasaki Y, Kotani K, Tanaka A, Abiko K, Ogawa H: Detection of mycoplasma in mastitic milk by PCR analysis and culture method. J Vet Med Sci, 63 (6): 691-693, 2001.
19. Hogan JS, Smith KL, Hoblet KH, Schoenberger PS, Todhunter DA, Hueston WD, Pritchard DE, Bowman GL, Heider LE, Brockett BL: Field survey of clinical mastitis in low somatic cell count herds. J Dairy Sci, 72, 1547-1556, 1989. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(89)79266-3
20. Karahan M, Kalın R, Atıl E, Çetinkaya B: Detection of Mycoplasma bovis in cattle with mastitis and respiratory problems in Eastern Turkey. Vet Rec, 166, 827-829, 2010. DOI: 10.1136/vr.b4864
21. Koivula M, Pitkälä A, Pyörälä S, Mäntysaari EA: Distribution of bacteria and seasonal and regional effects in a new database for mastitis pathogens in Finland. Acta Agric Scand A, 57, 89-96, 2007. DOI: 10.1080/09064700701488941
22. Makovec JA, Ruegg PL: Results of milk samples submitted for microbiological examination in Wisconsin from 1994 to 2001. J Dairy Sci, 86, 3466-3472, 2003. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(03)73951-4
23. Mcdonald JS: Bovine mastitis: Introductory remarks. J Dairy Sci, 62, 117-118, 1979. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(79)83212-9
24. National Mastitis Council: Microbiological procedures for the diagnosis of bovine udder infection and determination of milk quality. 4th edn., National Mastitis Council, Madison, WI. 2004.
25. Nevala M, Taponen S, Pyörälä S: Bacterial etiology of bovine clinical mastitis-data from saari ambulatory clinic in 2002-2003. Finnish Vet J, 110, 363- 369, 2004.
26. Olde Riekerink RG, Barkema HW, Kelton DF, Scholl DT: Incidence rate of clinical mastitis on Canadian dairy farms. J Dairy Sci, 91, 1366-1377, 2008. DOI: 10.3168/jds.2007-0757
27. Phuektes P, Browning GF, Anderson G, Mansell PD: Multiplex polymerase chain reaction as a mastitis screening test for Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae and Streptococcus uberis in bulk milk samples. J Dairy Res, 70 (2):149-155, 2003. DOI: 10.1017/ S0022029903006010
28. Phuektes P, Mansell PD, Browning GF: Multiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Staphylococcus aureus and Streptococcal causes of bovine mastitis. J Dairy Sci, 84 (5):1140-1148, 2001. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(01)74574-2
29. Pyorala S: Trends and advances in mastitis therapy. In, Kaske M, Scholz H, Höltershinken M (Eds): Recent developments and perspectives in bovine medicine. 360-368, Keynote Lectures in XXII World Buiatrics Congress, Hannover, Germany Hildesheimer Druck und Verlag-GmbH, Hildesheim, Germany, 2002.
30. Rainard P, Riollet C: Innate immunity of the bovine mammary gland. Vet Res, 37, 369-400, 2006. DOI: 10.1051/vetres:2006007
31. Ramesh A, Padmapriya BP, Chandrashekar A, Varadaraj MC: Application of a convenient DNA extraction method and multiplex PCR for the direct detection of Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica in milk samples. Mol Cell Probes, 16, 307-314, 2002. DOI: 10.1006/mcpr.2002.0428
32. Riffon R, Sayasith K, Khalil H, Dubreuil P, Drolet M, Lagace J: Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR. J Clin Microbiol, 39, 2584-2589, 2001. DOI: 10.1128/JCM.39.7.2584-2589.2001
33. Rosengarten R, Citti C: The role of ruminant mycoplasmas in systemic infection. In, Stipkovits L, Rosengarten R, Frey J (Eds): Mycoplasmas of Ruminants: Pathogenicity, Diagnostics, Epidemiology and Molecular Genetics, 3, 71-74, European Commission, Brussels, 1999.
34. Sears PM, Smith BS, English PB, Herer PS, González RN: Shedding pattern of Staphylococcus aureus from bovine intramammary infections. J Dairy Sci, 73, 2785-2789, 1990. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(90)78964-3
35. Shome BR, Das Mitra S, Bhuvana M, Krithiga N, Velu D, Shome R, Isloor S, Barbuddhe SB, Rahman H: Multiplex PCR assay for species identification of bovine mastitis pathogens. J Appl Microbiol, 111 (6): 1349-1356, 2011. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2011.05169.x
36. Taponen S, Salmikivi L, Simojoki H, Koskinen MT, Pyörälä S: Realtime polymerase chain reaction-based identification of bacteria in milk samples from bovine clinical mastitis with no growth in conventional culturing. J Dairy Sci, 92 (6): 2610-2617, 2009. DOI: 10.3168/jds.2008-1729
37. Watss JL: Etiological agents of bovine mastitis. Vet Microbiol, 16, 41-66, 1988. DOI: 10.1016/0378-1135(88)90126-5

APA	KALIN R, karahan m, Acik M, TAŞDEMİR B, CETINKAYA B (2017). Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. , 925 - 931.
Chicago	KALIN Recep,karahan murat,Acik Mehmet Nuri,TAŞDEMİR Bülent,CETINKAYA BURHAN Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. (2017): 925 - 931.
MLA	KALIN Recep,karahan murat,Acik Mehmet Nuri,TAŞDEMİR Bülent,CETINKAYA BURHAN Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. , 2017, ss.925 - 931.
AMA	KALIN R,karahan m,Acik M,TAŞDEMİR B,CETINKAYA B Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. . 2017; 925 - 931.
Vancouver	KALIN R,karahan m,Acik M,TAŞDEMİR B,CETINKAYA B Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. . 2017; 925 - 931.
IEEE	KALIN R,karahan m,Acik M,TAŞDEMİR B,CETINKAYA B "Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi." , ss.925 - 931, 2017.
ISNAD	KALIN, Recep vd. "Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi". (2017), 925-931.

APA	KALIN R, karahan m, Acik M, TAŞDEMİR B, CETINKAYA B (2017). Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 23(6), 925 - 931.
Chicago	KALIN Recep,karahan murat,Acik Mehmet Nuri,TAŞDEMİR Bülent,CETINKAYA BURHAN Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 23, no.6 (2017): 925 - 931.
MLA	KALIN Recep,karahan murat,Acik Mehmet Nuri,TAŞDEMİR Bülent,CETINKAYA BURHAN Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, vol.23, no.6, 2017, ss.925 - 931.
AMA	KALIN R,karahan m,Acik M,TAŞDEMİR B,CETINKAYA B Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi. 2017; 23(6): 925 - 931.
Vancouver	KALIN R,karahan m,Acik M,TAŞDEMİR B,CETINKAYA B Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi. 2017; 23(6): 925 - 931.
IEEE	KALIN R,karahan m,Acik M,TAŞDEMİR B,CETINKAYA B "Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi." Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 23, ss.925 - 931, 2017.
ISNAD	KALIN, Recep vd. "Mastitisli İnek Sütlerinde Önemli Patojenlerin Direkt Tespiti İçin Bir Multipleks PCR Yönteminin Geliştirilmesi". Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 23/6 (2017), 925-931.