D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi

AYPEK, Hande; MEŞE ÖZÇİVİCİ, GÜLİSTAN

D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi

Hande AYPEK, (e, PhD, Department of Molecular Biology and Genetics Rm: D206, Izmir Institute of Technology, Urla 35430, Izmir, Turkey)

GÜLİSTAN MEŞE ÖZÇİVİCİ (e, PhD, Department of Molecular Biology and Genetics Rm: D206, Izmir Institute of Technology, Urla 35430, Izmir, Turkey)

Türk Biyokimya Dergisi

2 0

Yıl: 2017 Cilt: 42 Sayı: 2 Sayfa Aralığı: 195 - 202 Metin Dili: Türkçe İndeks Tarihi: 29-07-2022

D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi

Öz:

Giriş: Connexin molekülleri (Cx) kurdukları hücrelerarası kanallar ve hücrelerarası olmayan yarı kanallar sayesinde hücre yaşamını dengelemede önemli roller üstlenirler. İn vitro analizlerle keratitis-ichthyosis-deafness (KID) sendromuyla ilişkili Cx26 mutasyonlarının düzgün kapanamayan yarı kanalların oluşmasına sebep oldukları gösterilmiştir. Bu tip anormal çalışan yarı kanalların etkilediği moleküler / hücresel mekanizmalar son zamanlarda araştırılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada amacımız, daha önce yarı kanallar yaptıkları gösterilen Cx26'da oluşan KID sendromu mutasyonlarından D50A ve A88V'nin hücre biyolojisinde yaptığı değişiklikleri incelemektir.Yöntemler: Cx26-WT, D50Y ve A88V ile transfekte edilen HeLa ve N2A hücrelerinde neurobiotin boya alım deneyleriyle anormal yarı kanalların varlığı teyit edilmiş ve floresan mikroskop ve immunoboyamasıyla Cx26'nın hücre içi lokalizayonu belirlenmiştir. Son olarak, kalsiyum belirteci, Fluo-3AM ve akış sitometresi kullanarak hücre içi kalsiyum içeriği belirlenmiştir.Bulgular: Cx26-D50A ve A88V mutasyonları hücreler arası kanalların oluşumunu engellemiş, aynı zamanda mutant proteinler hücrede Golgi aygıtında lokalize olmuşlardır. Ek olarak normal Cx26 ile kıyaslandığında Cx26-D50A ve A88V bulunduran hücrelerde hücre içerisindeki kalsiyum miktarının arttığı tespit edilmiştir.Sonuç: KID hastalarında görülen epidermal bozuklukların oluşmasında, mutant Cx26 proteinlerinin Golgi aparatında tutularak ve anormal yarı kanal oluşturup hücresel kalsiyum dengesini bozarak çeşitli hücre fonksiyonlarında neden olduğu değişimlerin rol oynayabileceği düşünülmektedir

Anahtar Kelime:

Konular: Biyoloji Genel ve Dahili Tıp

Alteration of protein localization and intracellular calcium content due to connexin26 D50A and A88V mutations

Öz:

Introduction: Connexins (Cx) play essential roles in cellular homeostasis by forming gap junctions and non-junctional hemichannels. In vitro characterization of Cx26 mutations causing keratitis-ichthyosis-deafness (KID) syndrome, were shown to form leaky hemichannels. The molecular/cellular mechanisms affected by aberrant hemichannels have recently been elucidated. Here, we further wanted to characterize Cx26 KID syndrome mutations, D50A and A88V, which were shown to form aberrant hemichannels and remained unaddressed in the literature.Methods: Neurobiotin uptake assay in HeLa and N2A cells transfected with Cx26-WT, D50A or A88V verified the presence of aberrant hemichannels and immunofluorescent staining with fluorescent microscopy determined cellular localization of Cx26. Finally, intracellular calcium content was examined by using calcium indicator, Fluo-3AM, and flow cytometer.Results: Cx26-D50A and A88V mutations prevented the formation of gap junction plaques at cell-cell appositions and mutant proteins were observed to localize to the Golgi apparatus. Further, comparison of intracellular calcium content showed an increase in calcium amount in cells containing Cx26-D50A and A88V relative to Cx26-WT Conclusion: Retention of Cx26 in the Golgi apparatus and alteration in the intracellular calcium content due to KID syndrome mutations may influence various cellular processes that might contribute to development of epidermal phenotypes.

Anahtar Kelime:

Konular: Biyoloji Genel ve Dahili Tıp

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Erişime Açık

1. Oyamada M, Oyamada Y, Takamatsu T. Regulation of connexin expression. Biochim Biophys Acta 2005;1719:6–23.
2. Churko JM, Laird DW. Gap junction remodeling in skin repair following wounding and disease. Physiology (Bethesda) 2013;28:190–8.
3. White TW, Paul DL. Genetic diseases and gene knockouts reveal diverse connexin functions. Annu Rev Physiol 1999;61:283–310.
4. Valiunas V, Polosina YY, Miller H, Potapova IA, Valiuniene L, Doronin S, et al. Connexin-specific cell-to-cell transfer of short interfering RNA by gap junctions. J Physiol 2005;568(Pt 2):459–68.
5. Slavi N, Rubinos C, Li L, Sellitto C, White TW, Mathias R, et al. Connexin 46 (cx46) gap junctions provide a pathway for the delivery of glutathione to the lens nucleus. J Biol Chem 2014;289:32694–702.
6. Wang N, De Bock M, Decrock E, Bol M, Gadicherla A, Vinken M, et al. Paracrine signaling through plasma membrane hemichannels. Biochim Biophys Acta 2013;1828:35–50.
7. Valiunas V. Biophysical properties of connexin-45 gap junction hemichannels studied in vertebrate cells. J Gen Physiol 2002;119:147–64.
8. Bukauskas FF, Kreuzberg MM, Rackauskas M, Bukauskiene A, Bennett MV, Verselis VK, et al. Properties of mouse connexin 30.2 and human connexin 31.9 hemichannels: implications for atrioventricular conduction in the heart. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:9726–31.
9. Gonzalez D, Gomez-Hernandez JM, Barrio LC. Species specificity of mammalian connexin-26 to form open voltage-gated hemichannels. FASEB J 2006;20:2329–38.
10. Contreras JE, Sanchez HA, Eugenin EA, Speidel D, Theis M, Willecke K, et al. Metabolic inhibition induces opening of unapposed connexin 43 gap junction hemichannels and reduces gap junctional communication in cortical astrocytes in culture. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:495–500.
11. Anselmi F, Hernandez VH, Crispino G, Seydel A, Ortolano S, Roper SD, et al. ATP release through connexin hemichannels and gap junction transfer of second messengers propagate Ca2+ signals across the inner ear. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:18770–5.
12. Robertson J, Lang S, Lambert PA, Martin PE. Peptidoglycan derived from Staphylococcus epidermidis induces Connexin43 hemichannel activity with consequences on the innate immune response in endothelial cells. Biochem J 2010;432:133–43.
13. Montgomery JR, White TW, Martin BL, Turner ML, Holland SM. A novel connexin 26 gene mutation associated with features of the keratitis-ichthyosis-deafness syndrome and the follicular occlusion triad. J Am Acad Dermatol 2004;51:377–82.
14. Gerido DA, Derosa AM, Richard G, White TW. Aberrant hemichannel properties of Cx26 mutations causing skin disease and deafness. Am J Physiol Cell Physiol 2007;293:C337–45.
15. Mese G, Valiunas V, Brink PR, White TW. Connexin26 deafness associated mutations show altered permeability to large cationic molecules. Am J Physiol Cell Physiol 2008;295:C966–74.
16. Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, Lench NJ, Liang JN, Parry G, et al. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness. Nature 1997;387:80–3.
17. Richard G, Rouan F, Willoughby CE, Brown N, Chung P, Ryynänen M, et al. Missense mutations in GJB2 encoding connexin-26 cause the ectodermal dysplasia keratitis-ichthyosis-deafness syndrome. Am J Hum Genet 2002;70:1341–48.
18. Pfenniger A, Wohlwend A, Kwak BR. Mutations in connexin genes and disease. Eur J Clin Invest 2011;41:103–16.
19. Mese G, Richard G, White TW. Gap junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol 2007;127:2516–24.
20. Kelly JJ, Simek J, Laird DW. Mechanisms linking connexin mutations to human diseases. Cell Tissue Res 2015;360:701–21.
21. Lee JR, Derosa AM, White TW. Connexin mutations causing skin disease and deafness increase hemichannel activity and cell death when expressed in Xenopus oocytes. J Invest Dermatol 2009;129:870–78.
22. Garcia IE, Maripillan J, Jara O, Ceriani R, Palacios-Munoz A, Ramachandran J, et al. Keratitis-ichthyosis-deafness syndromeassociated Cx26 mutants produce nonfunctional gap junctions but hyperactive hemichannels when co-expressed with wild type Cx43. J Invest Dermatol 2015;135:1338–47.
23. Terrinoni A, Codispoti A, Serra V, Didona B, Bruno E, Nisticò R, et al. Connexin 26 (GJB2) mutations, causing KID Syndrome, are associated with cell death due to calcium gating deregulation. Biochem Biophys Res Commun 2010;394:909–14.
24. Denda M, Hosoi J, Asida Y. Visual imaging of ion distribution in human epidermis. Biochem Biophys Res Commun 2000;272:134–7.
25. Savignac M, Edir A, Simon M, Hovnanian A. Darier disease: a disease model of impaired calcium homeostasis in the skin. Biochim Biophys Acta 2011;1813:1111–7.
26. Mhaske PV, Levit NA, Li L, Wang HZ, Lee JR, Shuja Z, et al. The human Cx26-D50A and Cx26-A88V mutations causing keratitisichthyosis-deafness syndrome display increased hemichannel activity. Am J Physiol Cell Physiol 2013;304:C1150–8.
27. Demiray L, Ozcivici E. Bone marrow stem cells adapt to lowmagnitude vibrations by altering their cytoskeleton during quiescence and osteogenesis. Turkish J Biol 2015;39:88–97.
28. Caro AA, Cederbaum AI. Role of calcium and calcium-activated proteases in CYP2E1-dependent toxicity in HEPG2 cells. J Biol Chem 2002;277:104–13.
29. Mese G, Londin E, Mui R, Brink PR, White TW. Altered gating properties of functional Cx26 mutants associated with recessive non-syndromic hearing loss. Hum Genet 2004;115:191–9.
30. Zonta F, Buratto D, Cassini C, Bortolozzi M, Mammano F. Molecular dynamics simulations highlight structural and functional alterations in deafness-related M34T mutation of connexin 26. Front Physiol 2014;5:85.
31. Ambrosi C, Walker AE, Depriest AD, Cone AC, Lu C, Badger J, et al. Analysis of trafficking, stability and function of human connexin 26 gap junction channels with deafness-causing mutations in the fourth transmembrane helix. PLoS One 2013;8:e70916.
32. Rouan F, White TW, Brown N, Taylor AM, Lucke TW, Paul DL, et al. trans-dominant inhibition of connexin-43 by mutant connexin-26: implications for dominant connexin disorders affecting epidermal differentiation. J Cell Sci 2001;114(Pt 11):2105–13.
33. Lee JR, White TW. Connexin-26 mutations in deafness and skin disease. Expert Rev Mol Med 2009;11:e35.
34. Levit NA, Mese G, Basaly MG, White TW. Pathological hemichannels associated with human Cx26 mutations causing Keratitis-Ichthyosis-Deafness syndrome. Biochim Biophys Acta 2012;1818:2014–9.
35. Menon GK, Elias PM, Feingold KR. Integrity of the permeability barrier is crucial for maintenance of the epidermal calcium gradient. Br J Dermatol 1994;130:139–47.
36. Martin PE, Blundell G, Ahmad S, Errington RJ, Evans WH. Multiple pathways in the trafficking and assembly of connexin 26, 32
and 43 into gap junction intercellular communication channels. J Cell Sci 2001;114(Pt 21):3845–55.
37. Thomas T, Jordan K, Simek J, Shao Q, Jedeszko C, Walton P, et al. Mechanisms of Cx43 and Cx26 transport to the plasma membrane and gap junction regeneration. J.Cell Sci 2005; 118(Pt 19):4451–62.
38. Thomas T, Telford D, Laird DW. Functional domain mapping and selective trans-dominant effects exhibited by Cx26 disease-causing mutations. J Biol Chem 2004;279: 19157–68.
39. Su CC, Li SY, Su MC, Chen WC, Yang JJ. Mutation R184Q of connexin 26 in hearing loss patients has a dominant-negative effect on connexin 26 and connexin 30. Eur J Hum Genet 2010;18:1061–4.
40. Hicks SW, Machamer CE. Golgi structure in stress sensing and apoptosis. Biochim Biophys Acta 2005;1744:406–14.

APA	AYPEK H, MEŞE ÖZÇİVİCİ G (2017). D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. , 195 - 202.
Chicago	AYPEK Hande,MEŞE ÖZÇİVİCİ GÜLİSTAN D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. (2017): 195 - 202.
MLA	AYPEK Hande,MEŞE ÖZÇİVİCİ GÜLİSTAN D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. , 2017, ss.195 - 202.
AMA	AYPEK H,MEŞE ÖZÇİVİCİ G D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. . 2017; 195 - 202.
Vancouver	AYPEK H,MEŞE ÖZÇİVİCİ G D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. . 2017; 195 - 202.
IEEE	AYPEK H,MEŞE ÖZÇİVİCİ G "D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi." , ss.195 - 202, 2017.
ISNAD	AYPEK, Hande - MEŞE ÖZÇİVİCİ, GÜLİSTAN. "D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi". (2017), 195-202.

APA	AYPEK H, MEŞE ÖZÇİVİCİ G (2017). D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. Türk Biyokimya Dergisi, 42(2), 195 - 202.
Chicago	AYPEK Hande,MEŞE ÖZÇİVİCİ GÜLİSTAN D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. Türk Biyokimya Dergisi 42, no.2 (2017): 195 - 202.
MLA	AYPEK Hande,MEŞE ÖZÇİVİCİ GÜLİSTAN D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. Türk Biyokimya Dergisi, vol.42, no.2, 2017, ss.195 - 202.
AMA	AYPEK H,MEŞE ÖZÇİVİCİ G D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. Türk Biyokimya Dergisi. 2017; 42(2): 195 - 202.
Vancouver	AYPEK H,MEŞE ÖZÇİVİCİ G D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi. Türk Biyokimya Dergisi. 2017; 42(2): 195 - 202.
IEEE	AYPEK H,MEŞE ÖZÇİVİCİ G "D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi." Türk Biyokimya Dergisi, 42, ss.195 - 202, 2017.
ISNAD	AYPEK, Hande - MEŞE ÖZÇİVİCİ, GÜLİSTAN. "D50A ve A88V mutasyonlarına bağlı connexin26 protein lokalizasyonunun ve hücre içi kalsiyum miktarının değişimi". Türk Biyokimya Dergisi 42/2 (2017), 195-202.