Yıl: 2020 Cilt: 54 Sayı: 3 Sayfa Aralığı: 418 - 428 Metin Dili: Türkçe DOI: 10.5578/mb.69711 İndeks Tarihi: 15-10-2021

Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi

Öz:
İnsana özgül bir tür olan Pneumocystis jirovecii, immün sistemi baskılanmış kişilerde P.jirovecii pnömonisi (PCP)’ne neden olarak ölümcül enfeksiyonlara yol açmaktadır. Mikroorganizmanın tanısında direktmikroskopi altın standart olsa da düşük P.jirovecii yükünün gözlendiği insan immün yetmezlik virüsü (HIV)dışı immünsupresif hastalarda polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler yöntemlere gereksinimduyulmaktadır. Bu çalışmada gerçek zamanlı PCR (Rt-PCR) yönteminin P.jirovecii laboratuvar tanısındakideğerinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Tıbbi Parazitoloji Laboratuvarına PCP şüphesiyle gönderilen 658 hastanın bronkoalveoler lavaj (BAL) örneği çalışmayadahil edilmiştir. BAL sıvısı örnekleri P.jirovecii ribozomal RNA büyük alt ünitesini kodlayan mitokondriyalgeni (mtLSUrRNA) çoğaltan Rt-PCR yöntemi ile değerlendirilmiştir. Tüm örneklere Giemsa ve Gomori’ninmetenamin gümüş (GMG) boyaları uygulanırken Rt-PCR ile pozitif saptanan örnekler ayrıca nested-PCR(n-PCR) yöntemi ile de değerlendirilmiştir. Bu örneklerin 92 (%14.3)’si Rt-PCR ile pozitif olarak bulunmuştur. n-PCR ile 92 hastanın 85 (%92.4)’inde pozitiflik saptanmıştır. Mikroskobik inceleme sonucundaise örneklerin yalnızca yedisinde P.jirovecii kist ve trofozoitlerine rastlanmıştır. Rt-PCR pozitif hastalarınortalama “cycle threshold (CT)” değeri 29.7 (18.17 ≤ CT ≤ 37.96) olarak saptanmıştır. Bu hastalardakiP.jirovecii yükü 2.6 x 101-6.15 x 107 kopya/ml olarak hesaplanmıştır. n-PCR ile pozitif saptanan örneklerinRt-PCR’deki CT değerlerinin ortalaması (CTort= 29.2) ile negatif bulunanların ortalaması (CTort= 36.7)arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p< 0.01). Mikroskopisi pozitif olan örneklerin RtPCR’deki CT değerlerinın sırasıyla; 18.2, 20.9, 22.2, 24.3, 24.7, 26.5, 29.7 olduğu görülmüştür. Mikroskopisi pozitif ve negatif olan örneklerin CT ortalamaları arasındaki fark yine istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0.05). Pozitif bulunan hastalar tanılarına göre gruplandığında; en düşük CT değer ortalamasının (CTort=24.8) HIV pozitif hastalarda olduğu görülmüştür. Organ transplantasyonu hastaları (CTort= 26.15) vekolajen-vasküler-enflamatuvar hasta grubunda (CTort= 27.8) saptanan CT değer ortalamaları diğer gruplardan istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşük bulunmuştur. Bu çalışma, Rt-PCR’nin P.jirovecii laboratuvar tanısında etkili bir yöntem olduğunu ortaya koymuştur. Konvansiyonel n-PCR yönteminin çok düşükyoğunluktaki etken varlığında Rt-PCR’ye göre daha başarısız olduğu; direkt mikroskopinin ise genellikleetkenin yoğun olduğu örneklerde pozitif sonuç verdiği anlaşılmaktadır.
Anahtar Kelime:

Evaluation of Real-Time Polymerase Chain Reaction in Pneumocystis jirovecii Laboratory Diagnosis

Öz:
Pneumocystis jirovecii is a human-specific species and causes fatal infections like P.jirovecii pneumonia (PCP) in immunocompromised persons. Although direct microscopy is the gold standard in the diagnosis of the microorganism, molecular methods such as polymerase chain reaction (PCR) are needed in non-human immune deficiency virus (HIV) immunosuppresive patients with low P.jirovecii burden. In this study, we aimed to evaluate the value of real-time PCR (Rt-PCR) in the laboratory diagnosis of P.jirovecii. Bronchoalveolar lavage (BAL) specimens of 658 patients sent to Dokuz Eylul University Hospital Central Medical Parasitology Laboratory on suspicion of PCP were included in the study. BAL fluids were evaluated for identification of P.jirovecii mitochondrial gene coding ribosomal large subunit (mtLSUrRNA) using Rt-PCR. In addition, Giemsa and Gomori’s methenamine silver (GMG) staining assays were applied to all samples and nested PCR (n-PCR) assay was applied to positive samples detected by real time PCR. Ninety-two (14.3%) of these samples were positive by Rt-PCR. Of these 92 patients, 85 (92.4%) were positive with n-PCR. Only seven of the specimens had P.jirovecii cysts and trophozoites with microscopic examination. The mean cycle threshold (CT ) value of Rt-PCR positive patients was 29.7 (18.17 ≤ CT≤ 37.96). P.jirovecii load in these patients was calculated as 2.6 x 101-6.15 x 107 copies/ml. The difference between the mean CTvalues of n-PCR positive and negative results was statistically significant (p< 0.01). The CTvalues of Rt-PCR of the samples with positive microscopy were; 18.2, 20.9, 22.2, 24.3, 24.7, 26.5, 29.7. The difference between the CTmeans of the samples with positive and negative microscopy was statistically significant (p< 0.05). When positive patients were grouped according to their diagnosis; the lowest mean CTvalue (CTmean= 24.8) was found in HIV-positive patients. On the other hand, CTvalues were found to be significantly lower in the organ transplantation patients (CTmean= 26.15) and in the collagen-vascular-inflammatory patient group (CTmean= 27.8). This study demonstrated that Rt-PCR was the effective method in the diagnosis of P.jirovecii in the laboratory. Conventional n-PCR method was found to be more unsuccessful than Rt-PCR in the presence of very low density organism; direct microscopy is generally found to be positive in samples with a higher burden of P.jirovecii
Anahtar Kelime:

Belge Türü: Makale Makale Türü: Diğer Erişim Türü: Bibliyografik
  • 1. Otieno-Odhiambo P, Wasserman S, Hoving JC. The contribution of host cells to Pneumocystis immunity: An update. Pathogens 2019; 8(2): 52.
  • 2. Tasaka S, Tokuda H. Pneumocystis jirovecii pneumonia in non-HIV-infected patients in the era of novel immunosuppressive therapies. J Infect Chemother 2012; 18(6): 793-806.
  • 3. Roux A, Gonzalez F, Roux M, Mehrad M, Menotti J, Zahar JR, et al. Update on pulmonary Pneumocystis jirovecii infection in non-HIV patients. Med Mal Infect 2014; 44(5): 185-98.
  • 4. Tasaka S. Recent advances in the diagnosis and management of Pneumocystis pneumonia. Tuberc Respir Dis 2020; 83(2): 132-40.
  • 5. Cordonnier C, Alanio A, Cesaro S, Maschmeyer G, Einsele H, Donnelly P, et al. Pneumocystisjiroveciipneumonia: still a concern in patients with haematological malignancies and stem cell transplant recipients-authors› response. J Antimicrob Chemother 2017; 72(4): 1266-8.
  • 6. Delliere S, Gits-Muselli M, Bretagne S, Alanio A. Outbreak-causing fungi: Pneumocystis jirovecii. Mycopathologia 2019; Nov 28.
  • 7. Song Y, Ren Y, Wang X, Li R. Recent advances in the diagnosis of Pneumocystis pneumonia. Med Mycol J 2016; 57: 111-6.
  • 8. Töz S, Gündüz C, Tetik A, Taşbakan M, Pullukçu H, Bacakoğlu F, et al. The comparison of microscopy and real time polymerase chain reaction methods for the diagnosis of Pneumocystis jirovecii pneumonia: evaluation of clinical parameters.Tuberk Toraks 2017; 65(3): 220-6.
  • 9. White PL, Backx M, Barnes RA. Diagnosis and management of Pneumocystis jirovecii infection. Expert Rev Anti Infect Ther 2017; 15: 435-47.
  • 10. Tia T, Putaporntip C, Kosuwin R, Kongpolprom N, Kawkitinarong K, Jongwutiwes S. A highly sensitive novel PCR assay for detection of P.jirovecii DNA in bronchoalveloar lavagespecimens from immunocompromised patients. Clin Microbiol Infect 2012; 18(6): 598-603.
  • 11. Doyle L, Vogel S, Procop GW. Pneumocystis PCR: it is time to make PCR the test of choice. Open Forum Infect Dis 2017; 4: 4.
  • 12. de Armas Y, Friaza V, Capo V, Durand-Joly I, Govín A, de la Horra C, et al. Low genetic diversity of Pneumocystis jirovecii among Cuban population based on two-locus mitochondrial typing. Med Mycol 2012; 50(4): 417-20.
  • 13. Monroy-Vaca EX, de Armas Y, Illnait-Zaragozi MT, Torano G, Diaz R, Vega D, et al. Prevalence and genotype distribution of Pneumocystis jirovecii in Cuban infants and toddlers with whooping cough. J Clin Microbiol 2014; 52(1): 45-51.
  • 14. Dimonte S, Berrilli F, D’Orazi C, D’Alfonso R, Placco F, Bordi E, et al. Molecular analysis based on mtLSU-rRNA and DHPS sequences of Pneumocystis jirovecii from immunocompromised and immunocompetent patients in Italy. Infect Genet Evol 2013; 14: 68-72.
  • 15. Özkoç S, Bayram Delibaş S. Investigation of Pneumocystis jirovecii pneumonia and colonization in iatrogenically immunosuppressed and immunocompetent patients. Mikrobiyol Bul 2015; 49(2): 221-30.
  • 16. Calderon EJ, Dei-Cas E. Pneumocystis infection: unraveling the colonization-to-disease shift. Expert Rev Anti Infect Ther 2010; 8(3): 259-62.
  • 17. Festic E, Gajic O, Limper AH, Aksamit TR. Acute respiratory failure due to Pneumocystis pneumonia in patients without human immunodeficiency virus infection: outcome and associated features. Chest 2005; 128(2): 573-9.
  • 18. Salzer HJF, Schäfer G, Hoenigl M, Günther G, Hoffmann C, Kalsdorf B, et al. Clinical, diagnostic, and treatment disparities between HIV-Infected and non-HIV-Infected immunocompromised patients with Pneumocystis jirovecii pneumonia. Respiration 2018; 96(1): 52-65.
  • 19. Cereser L, Dallorto A, Candoni A, Volpetti S, Righi E, Zuiani C, et al. Pneumocystis jirovecii pneumonia at chest high-resolution computed tomography (HRCT) in non-HIV immunocompromised patients: Spectrum of findings and mimickers. Eur J Radiol 2019; 116: 116-27.
  • 20. Morris A, Norris KA. Colonization by Pneumocystis jirovecii and its role in disease. Clin Microbiol Rev 2012; 25(2): 297-317.
  • 21. Alanio A, Hauser PM, Lagrou K, Melchers WJ, Helweg-Larsen J, Matos O, et al. ECIL guidelines for the diagnosis of Pneumocystis jirovecii pneumonia in patients with haematological malignancies and stem cell transplant recipients. J Antimicrob Chemother 2016; 71(9): 2386-96.
  • 22. Maillet M, Maubon D, Brion JP, François P, Molina L, Stahl JP, et al. Pneumocystis jirovecii (Pj) quantitative PCR to differentiate Pj pneumonia from Pj colonization in immunocompromised patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2014; 33(3): 331-6.
  • 23. Fauchier T, Hasseine L, Gari-Toussaint M, Casanova V, Marty PM, Pomares C. Detection of Pneumocystis jirovecii by quantitative PCR to differentiate colonization and pneumonia in Immunocompromised HIVpositive and HIV-negative patients. J Clin Microbiol 2016; 54(6): 1487-95.
  • 24. Hoarau G, Le Gal S, Zunic P, Poubeau P, Antok E, Jaubert J, et al. Evaluation of quantitative FTD-Pneumocystis jirovecii kit for Pneumocystis infection diagnosis. Diagn Microbiol Infect Dis 2017; 89(3): 212-7.
  • 25. Larsen HH, Masur H, Kovacs JA, Gill VJ, Silcott VA, Kogulan P, et al. Development and evaluation of a quantitative, touch-down, real-time PCR assay for diagnosing Pneumocystis carinii pneumonia. J Clin Microbiol 2002; 40(2): 490-4.
  • 26. Alanio A, Desoubeaux G, Sarfati C, Hamane S, Bergeron A, Azoulay E, et al. Real-time PCR assaybased strategy for differentiation between active Pneumocystis jirovecii pneumonia and colonization in immunocompromised patients. Clin Microbiol Infect 2011; 17(10): 1531-7.
  • 27. Unnewehr M, Friederichs H, Bartsch P, Schaaf B. High diagnostic value of a new real-time pneumocystis PCR from bronchoalveolar lavage in a real-life clinical setting. Respiration 2016; 92(3): 144-9.
  • 28. Fillaux J, Malvy S, Alvarez M, Fabre R, Cassaing S, Marchou B, et al. Accuracy of a routine real-time PCR assay for the diagnosis of Pneumocystis jirovecii pneumonia. J Microbiol Methods 2008; 75(2): 258-61.
  • 29. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009; 55(4): 611-22.
APA Ozkoc S, Ergüden Gürbüz C, SAYINER A, Bayram Delibaş S (2020). Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. , 418 - 428. 10.5578/mb.69711
Chicago Ozkoc Soykan,Ergüden Gürbüz Ceren,SAYINER AYCA ARZU,Bayram Delibaş Songül Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. (2020): 418 - 428. 10.5578/mb.69711
MLA Ozkoc Soykan,Ergüden Gürbüz Ceren,SAYINER AYCA ARZU,Bayram Delibaş Songül Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. , 2020, ss.418 - 428. 10.5578/mb.69711
AMA Ozkoc S,Ergüden Gürbüz C,SAYINER A,Bayram Delibaş S Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. . 2020; 418 - 428. 10.5578/mb.69711
Vancouver Ozkoc S,Ergüden Gürbüz C,SAYINER A,Bayram Delibaş S Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. . 2020; 418 - 428. 10.5578/mb.69711
IEEE Ozkoc S,Ergüden Gürbüz C,SAYINER A,Bayram Delibaş S "Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi." , ss.418 - 428, 2020. 10.5578/mb.69711
ISNAD Ozkoc, Soykan vd. "Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi". (2020), 418-428. https://doi.org/10.5578/mb.69711
APA Ozkoc S, Ergüden Gürbüz C, SAYINER A, Bayram Delibaş S (2020). Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni, 54(3), 418 - 428. 10.5578/mb.69711
Chicago Ozkoc Soykan,Ergüden Gürbüz Ceren,SAYINER AYCA ARZU,Bayram Delibaş Songül Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni 54, no.3 (2020): 418 - 428. 10.5578/mb.69711
MLA Ozkoc Soykan,Ergüden Gürbüz Ceren,SAYINER AYCA ARZU,Bayram Delibaş Songül Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni, vol.54, no.3, 2020, ss.418 - 428. 10.5578/mb.69711
AMA Ozkoc S,Ergüden Gürbüz C,SAYINER A,Bayram Delibaş S Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni. 2020; 54(3): 418 - 428. 10.5578/mb.69711
Vancouver Ozkoc S,Ergüden Gürbüz C,SAYINER A,Bayram Delibaş S Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni. 2020; 54(3): 418 - 428. 10.5578/mb.69711
IEEE Ozkoc S,Ergüden Gürbüz C,SAYINER A,Bayram Delibaş S "Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi." Mikrobiyoloji Bülteni, 54, ss.418 - 428, 2020. 10.5578/mb.69711
ISNAD Ozkoc, Soykan vd. "Pneumocystis jirovecii Laboratuvar Tanısında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Değerlendirilmesi". Mikrobiyoloji Bülteni 54/3 (2020), 418-428. https://doi.org/10.5578/mb.69711