Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması
Yıl: 2022 Cilt: 56 Sayı: 2 Sayfa Aralığı: 191 - 205 Metin Dili: Türkçe DOI: 10.5578/mb.20229801 İndeks Tarihi: 21-06-2022
Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması
Öz: Pirazinamid (PZA), tüberküloz (TB) tedavisinde kullanılan birinci seçenek anti-TB ilaçlardandır. PZA’nın
persistan haldeki basilleri ortadan kaldırarak tedavi süresini 9-12 aydan altı aya kısaltabilme yeteneği göz
önüne alındığında, tedavi rejiminin önemli bir taşını oluşturduğu görülmüştür. PZA direncine neden olan
temel mekanizma %70-97 oranında pncA mutasyonları iken, rpsA ve panD mutasyonlarının da dirence
neden olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada, PZA dirençli Mycobacterium tuberculosis izolatlarında dirençle
ilişkilendirilen pncA, rpsA ve panD gen mutasyonlarını, PZA direncini belirlemede pirazinamidaz (PZAz)
enzim testinin etkinliğini, antitüberküloz ilaç duyarlılığını ve spoligotipleme yöntemi ile izolatların ait oldukları aileleri belirlemek amaçlanmıştır. Çalışmaya PZA dirençli 46 M.tuberculosis izolatı dahil edilmiştir.
PZA direnci ile ilişkilendirilen pncA, rpsA, panD mutasyonları in-house polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
yöntemini takiben uygulanan DNA dizilemeyle araştırılmıştır. İzolatların ilaç duyarlılıkları Bactec MGIT 960
(Becton Dickinson, ABD) sistemiyle, PZAz varlığı kolorimetrik PZAz enzim testiyle ve ailelerin belirlenmesi
spoligotiplendirme yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. PZA dirençli 46 izolatın 24 (%52.2)’ü PZA’e tek başına dirençli, 11 (%23.9)’i çok ilaca dirençli (ÇİD)-TB ve 11 (%23.9)’i de birden çok ilaca dirençli (BÇİD)-TB
olarak tespit edilmiştir. PZA dirençli M.tuberculosis izolatlarının %73.9 (34)’unda direnç ile ilişki gen mutasyonları saptanmıştır. İzolatların %71.7(33)’sinde pncA, %28.2 (13)’sinde rpsA ve %4.3 (n= 2)’ünde panD
mutasyonları tespit edilmiştir. Mutasyon saptanan 12 izolatta pncA/rpsA gen mutasyonları ve iki izolatta
pncA/panD gen mutasyonları birlikteliği belirlenmiştir. Kolorimetrik PZAz testi ile enzim varlığı tespit edilen
9 (%19.6) izolatın 3 (%33.3)’ünde pncA gen mutasyonları gözlenmiştir. pncA geninde A226C (%27.3),
A152C (%24.2), C169G (%21.2) A422C (%9.1), G145A (%6.1), A29G (%6.1), A424G (%3) ve T464G
(%3) olmak üzere “missense” mutasyon şeklinde sekiz farklı nokta mutasyonu tespit edilmiştir. rpsA geninde en sık A636C (%42.9) sessiz mutasyonlar ve G1318A (%42.9) “missense” mutasyonlar; panD geninde
ise C66G (%50) “nonsense” ve A145G (%50) “missense” mutasyonlar saptanmıştır. PZA dirençli izolatların genotiplendirilmesi sonucunda en sık karşılaşılan genotiplerin 17 (%36.9) izolat ile T1 kümesinde yer
aldığı; bunu sırası ile 7 (%15.2) izolat ile Beijing, 6 (%13) izolat ile H3, 5 (%10.9) izolat ile TUR ve 4 (%8.7)
izolat ile LAM 9 ailelerinin takip ettiği belirlenmiştir. Ayrıca ORPHAN ailesine ait 2 (%4.3) izolat; LAM TUR,
LAM 2, LAM 7, T2, T5-RUS1 ailelerine ait birer izolat tespit edilmiştir. Çalışmamız, Türkiye’de PZA direncine
neden olduğu tespit edilmiş pncA, rpsA ve panD gen mutasyonlarının tamamının araştırıldığı ilk çalışmadır.
PZA direnci ile ilgili yapılan epidemiyolojik araştırmalar, direnç mekanizmasının aydınlatılmasına ve direncin saptanmasına yönelik hızlı tanı sağlayacak yöntemlerin geliştirilmesine önemli katkılar sağlayacaktır.
Anahtar Kelime: Investigation of pncA, rpsA and panD Gene MutationsAssociated with Resistance in Pyrazinamide-ResistantMycobacterium tuberculosis Isolates and Spoligotyping
Öz: Pyrazinamide (PZA) is one of the first-line anti-tuberculous drugs used in the treatment of tuberculosis
(TB). Considering the ability of PZA to shorten the treatment period from 9-12 months to six months by
eliminating persistent bacilli, it appears to be an important cornerstone of TB therapy. While the main
mechanism causing the PZA resistance is pncA mutations at a rate of 70-97%, it has been determined
that rpsA and panD mutations can also cause resistance. In this study, we aimed to investigate the pncA,
rpsA and panD gene mutations, the efficiency of the pyrazinamidase (PZAse) enzyme test in determining
PZA resistance, the drug susceptibility and their families in PZA-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. Totally 46 PZA resistant M.tuberculosis isolates were included in the study. The pncA, rpsA and panD
mutations caused by PZA resistance were investigated by in-house PCR followed by DNA sequencing
method. Drug susceptibility was determined with Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson, USA) system,
the presence of PZAse was evaluated by colorimetric PZAse enzyme assay and the families were determined by the spoligotyping method. Of the 46 PZA-resistant isolates, 24 (52.2%) were identified as PZA
monoresistant, 11 (23.9%) multidrug resistant (MDR)-TB and 11 (23.9%) poly drug resistant (PDR)-TB.
Gene mutations associated with resistance were detected in 73.9% (34) of PZA-resistant M.tuberculosis
isolates. The pncA, rpsA and panD mutations were found in 71.7% (33), 28.2% (12) and 4.3% (2) of the
isolates, respectively. The coexistence of pncA/rpsA and pncA/panD gene mutations were determined in
12 and two isolates, respectively. The pncA gene mutations were observed in 3 (33.3%) of 9 (19.6%)
isolates whose enzyme presence was detected by the colorimetric PZAse test. In the pncA gene, eight
different point mutations in the form of missense mutation;A226C (27.3%), A152C (24.2%), C169G
(21.2%) A422C (9.1%), G145A (6.1%), A29G (6.1%), A424G (3%) and T464G (3%) were detected. In
the rpsA gene, A636C (42.9%) silent and G1318A (42.9%) missense mutations and in the panD gene,
C66G (50%) nonsense and A145G (50%) missense mutations were the most common mutations detected. As a result of genotyping of PZA resistant isolates, the most common genotypes were found in T1
cluster with 17 (36.9%) isolates; followed by the families of Beijing with 7 (15.2%) isolates, H3 with 6
(13%) isolates, TUR with 5 (10.9%) isolates, and LAM 9 with 4 (8.7%) isolates, respectively. In addition,
2 (4.3%) isolates belonging to the ORPHAN family and one isolate belonging to each of LAM TUR, LAM
2, LAM 7, T2, T5-RUS1 families were identified. Our study is the first to investigate all pncA, rpsA and
panD gene mutations that have been found to cause PZA resistance in Türkiye. Epidemiological studies
on PZA resistance will make important contributions to the determination of resistance mechanism and
the development of methods that will provide rapid diagnosis for the detection of resistance.
Anahtar Kelime: Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Bibliyografik
- 1. Akhmetova A, Kozhamkulov U, Bismilda V, Chingissova L, Abildaev T, Dymova M, et al. Mutations in the pncA and rpsA genes among 77 Mycobacterium tuberculosis isolates in Kazakhstan. Int J Tuberc Lung Dis 2015; 19(2): 179-84. https://doi.org/10.5588/ijtld.14.0305
- 2. Njire M, Tan Y, Mugweru J, Wang C, Guo J, Yew W, et al. Pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis: Review and update. Adv Med Sci 2016; 61(1): 63-71. https://doi.org/10.1016/j.advms.2015.09.007
- 3. Chang KC, Yew WW, Zhang Y. Pyrazinamide susceptibility testing in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review with meta-analyses. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55(10): 4499-505. https://doi. org/10.1128/AAC.00630-11
- 4. Gu Y, Yu X, Jiang G, Wang X, Ma Y, Li Y, et al. Pyrazinamide resistance among multidrug-resistant tuberculosis clinical isolates in a national referral center of China and its correlations with pncA, rpsA, and panD gene mutations. Diagn Microbiol Infect Dis 2016; 84(3): 207-11. https://doi.org/10.1016/j. diagmicrobio.2015.10.017
- 5. Shi W, Zhang X, Jiang X, Yuan H, Lee JS, Barry CE 3rd, et al. Pyrazinamide inhibits trans-translation in Mycobacterium tuberculosis. Science 2011; 333(6049): 1630-2. https://doi.org/10.1126/science.1208813
- 6. Zhang Y, Shi W, Zhang W, Mitchison D. Mechanisms of pyrazinamide action and resistance. Microbiol Spectr 2014; 2(4): 2-4. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.MGM2-0023-2013
- 7. Bhuju S, de Souza Fonseca L, Marsico AG, de Oliveira Vieira GB, Sobral LF, Stehr M, et al. Mycobacterium tuberculosis isolates from Rio de Janeiro reveal unusually low correlation between pyrazinamide resistance and mutations in the pncA gene. Infect Genet Evol 2013; 19: 1-6. https://doi.org/10.1016/j. meegid.2013.06.008
- 8. Alexander DC, Ma JH, Guthrie JL, Blair J, Chedore P, Jamieson FB. Gene sequencing for routine verification of pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis: a role for pncA but not rpsA. J Clin Microbiol 2012; 50(11): 3726-8. https://doi.org/10.1128/JCM.00620-12
- 9. Juréen P, Werngren J, Toro JC, Hoffner S. Pyrazinamide resistance and pncA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52(5): 1852-4. https://doi.org/10.1128/AAC.00110-08
- 10. Zhang S, Chen J, Shi W, Liu W, Zhang W, Zhang Y. Mutations in panD encoding aspartate decarboxylase are associated with pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis. Emerg Microbes Infect 2013; 2(1): 1-5. https://doi.org/10.1038/emi.2013.38
- 11. Hameed HMA, Islam MM, Chhotaray C, Wang C, Liu Y, Tan Y, et al. Molecular targets related drug resistance mechanisms in MDR-, XDR-, and TDR-Mycobacterium tuberculosis Strains. Front Cell Infect Microbiol 2018; 8: 114. https://doi.org/10.3389/fcimb.2018.00114
- 12. Clinical and Laboratory Standards Institute. Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardia, and other aerobic Actinomycetes. Approved Standard, 2nd ed. CLSI Document M24-A2, 2011. Wayne, PA.
- 13. Ramirez-Busby SM, Valafar F. Systematic review of mutations in pyrazinamidase associated with pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother 2015; 59(9): 5267- 77. https://doi.org/10.1128/AAC.00204-15
- 14. Özkütük N, Ecemiş T, Sürücüoğlu S. Manisa bölgesinde pirazinamid-monorezistan Mycobacterium tuberculosis. Mikrobiyol Bul 2008; 42(4): 585-90.
- 15. Wayne LG. Simple pyrazinamidase and urease tests for routine identification of mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1974; 109(1): 147-51.
- 16. Issues in Mycobacterium tuberculosis complex (mtbc) drug susceptibility testing: Pyrazinamide (PZA) Aphl Issues In Brıef Infectıous Dıseases 2016.
- 17. Sajduda A, Brzostek A, Popławska M, Augustynowicz-Kopec E, Zwolska Z, Niemann S, et al. Molecular characterization of rifampin-and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Poland. J Clin Microbiol 2004; 42(6): 2425-31. https://doi.org/10.1128/JCM.42.6.2425-2431.2004
- 18. Louw GE, Warren RM, Donald PR, Murray MB, Bosman M, Van Helden PD, et al. Frequency and implications of pyrazinamide resistance in managing previously treated tuberculosis patients. Int J Tuberc Lung Dis 2006; 10(7): 802-7.
- 19. Mphahlele M, Syre H, Valvatne H, Stavrum R, Mannsåker T, Muthivhi T, et al. Pyrazinamide resistance among South African multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. J Clin Microbiol 2008; 46(10): 3459-64. https://doi.org/10.1128/JCM.00973-08
- 20. Lee KW, Lee JM, Jung KS. Characterization of pncA mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis in Korea. J Korean Med Sci 2001;16(5): 537-43. https://doi.org/10.3346/jkms.2001.16.5.537
- 21. Pandey S, Newton S, Upton A, Roberts S, Drinković D. Characterisation of pncA mutations in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in New Zealand. Pathology 2009; 41(6): 582-4. https://doi. org/10.1080/00313020903071587
- 22. Bishop KS, Blumberg L, Trollip AP, Smith AN, Roux L, York DF, et al. Characterisation of the pncA gene in Mycobacterium tuberculosis isolates from Gauteng, South Africa. Int J Tuberc Lung Dis 2001; 5(10): 952-7.
- 23. Chan RC, Hui M, Chan EW, Au TK, Chin ML, Yip CK, et al. Genetic and phenotypic characterization of drugresistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Hong Kong. J Antimicrob Chemother 2007; 59(5): 866-73. https://doi.org/10.1093/jac/dkm054
- 24. Whitfield MG, Soeters HM, Warren RM, York T, Sampson SL, Streicher EM, et al. A global perspective on pyrazinamide resistance: systematic review and meta-analysis. PLoS One 2015; 10(7): e0133869. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0133869
- 25. Doustdar F, Khosravi AD, Farnia P. Mycobacterium tuberculosis genotypic diversity in pyrazinamide-resistant isolates of Iran. Microb Drug Resist 2009; 15(4): 251-6. https://doi.org/10.1089/mdr.2009.0066
- 26. Denkin S, Volokhov D, Chizhikov V, Zhang Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J Med Microbiol 2005; 54(Pt 12): 1127-31. https://doi.org/10.1099/ jmm.0.46129-0
- 27. Yüksel P. Pirazinamide dirençli Mycobacterium tuberculosis kompleks kökenlerinde pncA genindeki mutasyonların araştırılması. Yayımlanmış doktora tezi, Trakya Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 2005, Edirne.
- 28. Akbal AU. Mycobacterium tuberculosis izolatlarında pirazinamid direncinin hızlı tespitinde kolorimetrik yöntemlerin etkinliğinin araştırılması. Doktora tezi, Ondokuz Mayıs Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 2018, Samsun.
- 29. Xia Q, Zhao LL, Li F, Fan YM, Chen YY, Wu BB, et al. Phenotypic and genotypic characterization of pyrazinamide resistance among multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Zhejiang, China. Antimicrob Agents Chemother. 2015; 59(3): 1690-5. https://doi.org/10.1128/AAC.04541-14
- 30. Zeytinli UO, Köksal F. Genotyping of Mycobacterium tuberculosis strains isolated from pulmonary tuberculosis patients in Çukurova region, Turkey by spoligotyping and MIRU-VNTR methods. Mikrobiyol Bul 2012; 46(2); 202-10.
- 31. Durmaz R, Zozio T, Günal S, Yaman A, Çavuşoğlu C, Güney C, et al. Genetic diversity and major spoligotype families of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from different regions of Turkey. Infect Genet Evol 2007; 7(4): 513-19. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2007.03.003
- 32. Karslıgil T, Bayram A, Ekşi F. Determination of genotypic varieties and genotyping of multiple drug-resistant tuberculosis by the RFLP and spoligotyping methods. Turk J Med Sci 2016; 46(5): 1502-11. https://doi. org/10.3906/sag-1412-5
- 33. Bwalya P, Yamaguchi T, Mulundu G, Nakajima C, Mbulo G, Solo ES, et al. Genotypic characterization of pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis isolated from Lusaka, Zambia. Tuberculosis 2018; 109: 117-22. https://doi.org/10.1016/j.tube.2017.12.007
| APA | ÖZGÜR D, Tezcan Ülger S, Kayar M, Bicmen C, arslanturk a, ÜLGER M, ASLAN G (2022). Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. , 191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| Chicago | ÖZGÜR Didem,Tezcan Ülger Seda,Kayar Mediha Begum,Bicmen Can,arslanturk ahmet,ÜLGER Mahmut,ASLAN GÖNÜL Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. (2022): 191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| MLA | ÖZGÜR Didem,Tezcan Ülger Seda,Kayar Mediha Begum,Bicmen Can,arslanturk ahmet,ÜLGER Mahmut,ASLAN GÖNÜL Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. , 2022, ss.191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| AMA | ÖZGÜR D,Tezcan Ülger S,Kayar M,Bicmen C,arslanturk a,ÜLGER M,ASLAN G Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. . 2022; 191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| Vancouver | ÖZGÜR D,Tezcan Ülger S,Kayar M,Bicmen C,arslanturk a,ÜLGER M,ASLAN G Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. . 2022; 191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| IEEE | ÖZGÜR D,Tezcan Ülger S,Kayar M,Bicmen C,arslanturk a,ÜLGER M,ASLAN G "Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması." , ss.191 - 205, 2022. 10.5578/mb.20229801 |
| ISNAD | ÖZGÜR, Didem vd. "Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması". (2022), 191-205. https://doi.org/10.5578/mb.20229801 |
| APA | ÖZGÜR D, Tezcan Ülger S, Kayar M, Bicmen C, arslanturk a, ÜLGER M, ASLAN G (2022). Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni, 56(2), 191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| Chicago | ÖZGÜR Didem,Tezcan Ülger Seda,Kayar Mediha Begum,Bicmen Can,arslanturk ahmet,ÜLGER Mahmut,ASLAN GÖNÜL Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni 56, no.2 (2022): 191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| MLA | ÖZGÜR Didem,Tezcan Ülger Seda,Kayar Mediha Begum,Bicmen Can,arslanturk ahmet,ÜLGER Mahmut,ASLAN GÖNÜL Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni, vol.56, no.2, 2022, ss.191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| AMA | ÖZGÜR D,Tezcan Ülger S,Kayar M,Bicmen C,arslanturk a,ÜLGER M,ASLAN G Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2022; 56(2): 191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| Vancouver | ÖZGÜR D,Tezcan Ülger S,Kayar M,Bicmen C,arslanturk a,ÜLGER M,ASLAN G Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2022; 56(2): 191 - 205. 10.5578/mb.20229801 |
| IEEE | ÖZGÜR D,Tezcan Ülger S,Kayar M,Bicmen C,arslanturk a,ÜLGER M,ASLAN G "Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması." Mikrobiyoloji Bülteni, 56, ss.191 - 205, 2022. 10.5578/mb.20229801 |
| ISNAD | ÖZGÜR, Didem vd. "Pirazinamid Dirençli Mycobacterium tuberculosis İzolatlarında Direnç ile İlişkili pncA, rpsA ve panD Gen Mutasyonları ve Spoligotiplerin Araştırılması". Mikrobiyoloji Bülteni 56/2 (2022), 191-205. https://doi.org/10.5578/mb.20229801 |
