Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması
Yıl: 2020 Cilt: 50 Sayı: 1 Sayfa Aralığı: 56 - 62 Metin Dili: Türkçe DOI: 10.5222/TMCD.2020.056 İndeks Tarihi: 30-04-2020
Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması
Öz: Amaç: Kan ve dokularda yerleşen paraziter hastalıklar insan sağlığı için dünya çapında büyük tehlikeoluşturmaktadır. Sıtma, leishmaniasis ve toksoplazmoz her yıl çok sayıda kişinin yaşamını kaybetmesineneden olmakta, tedavi maliyetleri ve iş gücü kaybı nedeniyle ülke ekonomilerine büyük yük getirmektedir. Bu çalışmada, Plasmodium spp., Leishmania spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek ZamanlıPolimeraz Zincir Reaksiyonu (GZ-PZR) ile klinik örneğin mikrolitresinde belirlenebilecek en düşük parazitsayısının belirlenmesi, test validasyonlarının yapılması ve GZ-PZR testinin rutin laboratuvarlara dâhiledilmesi amaçlanmıştır.Yöntem: Leishmania tropica (promastigot ve amastigot), L. infantum (promastigot ve amastigot),T. gondii Thoma lamı ile mikroskop altında sayılarak P. falciparum ve P. vivax ise yayma preparatlarhazırlanıp Giemsa ile boyandıktan sonra mikroskop altında incelenerek parazitemi yoğunluğu saptanmıştır. Daha sonra bu parazitlerin PBS solüsyonu ile mikrolitrede 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 2.500,5.000 ve 10.000 parazit olacak şekilde dilüsyonları yapılmıştır. Tüm parazit süspansiyonlarından DNAizolasyonu yapılarak GZ-PZR ile pozitif sonuç alınan en düşük parazit süspansiyonu belirlenmiştir. Dahasonra da negatif sonuç alınan süspansiyon ile bir önceki pozitif süspansiyon arası yine dilüsyon yapılaraktestin saptayabildiği en düşük parazit sayısı belirlenmiştir.Bulgular: GZ-PZR testinde P. falciparum ile L. tropica ve L. infantum’un promastigot ve amastigot formlarında en düşük parazit sayısı 10, P. vivax ve T. gondii parazitlerinde ise 12 olarak bulunmuştur.Tartışma: Leishmania spp., Plasmodium spp. ve T. gondii’nin GZ-PZR ile tanısında çok düşük sayıdakiparazitlerin başarı ile saptanması, bu testin her üç parazitin moleküler tanısında güvenle kullanılabileceğini düşündürmüştür.
Anahtar Kelime: Konular:
Identification of Leishmania spp., Plasmodium spp. and Toxoplasma gondii with Polymerase Chain Reaction: A Pilot Study for Limit Determination
Öz: Objective: Parasitic diseases that involve blood and tissues pose a significant threat to human health worldwide. Malaria, leishmaniasis and toxoplasmosis kill thousands of people worldwide annually, and impose a great burden on national economies due to treatment costs and loss of labour. The aim of this study are to determine the lowest number of parasites detectable by Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) for Plasmodium spp., Leishmania spp. and T. gondii and to validate the RT-PCR test, and integrate RT-PCR in routine laboratories applications. Methods: Leishmania tropica (both promastigotes and amastigotes), L. infantum (both promastigotes and amastigotes) and T. gondii were counted using a hemocytometer, while Giemsa-stained smears of P. falciparum and P. vivax were examined under the microscope to define their parasitic load. Then, dilutions as 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 2.500, 5.000 and 10.000 parasites/ul were prepared in PBS solutions. DNA isolation was performed from all parasite suspensions and the lowest parasite suspension which was positively detected by RT-PCR method was identified. This was followed by further dilutions between the previous negative and last positive dilutions, to further determine the lowest number of parasites that RT-PCR could eventually identify. Results: Our assessments showed that the lowest number of parasites necessary for positive RT-PCR were 10 for P. falciparum and amastigotes and promastigote forms of L. tropica/L. infantum, while 12 for P. vivax and T. gondii. Conclusion: These results show that RT-PCR is a reliable diagnostic option to be used successfully for the detection of Leishmania spp., Plasmodium spp. and T. gondii, even for infections with low parasitemia.
Anahtar Kelime: Konular:
Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Erişime Açık
- 1. Özbel Y, Özensoy TS. Leishmaniasis. İçinde: Özcel MA, Özbel Y, Ak M (Eds). Tıbbi Parazit Hastalıkları. İzmir: Türkiye Parazitoloji Derneği Yayını, 2007:22:197-241.
- 2. WHO. Leishmaniasis. 2019. http://www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs375/en [Erişim tarihi:10.10.2019]
- 3. Özcel MA. Sıtma Epidemiyolojisi. İçinde: Özcel MA (Eds). Tıbbi Parazit Hastalıkları. İzmir: Türkiye Parazitoloji Derneği Yayını, 2007;22:79-140.
- 4. WHO. World Malaria Report: WHO and UNICEF. 2005. http://www.rbm.who.int/wmr [Erişim tarihi:10.03.2011]
- 5. Özcel MA. Sıtma. İçinde: Özcel MA, Özbel Y, Ak M (Eds). Tıbbi Parazit Hastalıkları. İzmir: Türkiye Parazitoloji Derneği Yayını, 2007; No: 22;79-138.
- 6. Remington JS, McLeod R, Desmonts G. Toksoplazmosis. In: Infectious Diseases of the Fetus & Newborn Infant. 4th Ed. Remington&Klein. WB Saunders Company, 1992:5:140-267.
- 7. Novy FG, MacNeal WJ. On the cultivation of Trypanosoma brucei. J Infect Dis. 1904;1:1-30. https://doi.org/10.1093/infdis/1.1.1
- 8. Unat EK, Yücel A, Altaş K, Samastı M. Sıtma. Tıp Parazitolojisi. İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Yayınları. 1995:623-64.
- 9. Gürüz Y, Korkmaz M. Özellikli tanı yöntemleri. İçinde: Özcel MA, Altıntaş N (Eds). Parazit Hastalıklarında Tanı. İzmir: Parazitoloji Derneği Yayını, No:15. 1997:293- 318.
- 10. Montaya JG. Laboratory diagnosis of Toxoplasma gondii infection and toxoplasmosis. J Infect Dis. 2002;185(Suppl 1):S873-82. https://doi.org/10.1086/338827
- 11. Romand S, Chosson M, Franck J et al. Usefulness of quantitative polymerase chain reaction in amniotic fluid as early prognostic marker of fetal infection with Toxoplasma gondii. Am J Obstet Gynecol. 2004;190(3):797-802. https://doi.org/10.1016/j.ajog.2003.09.039
- 12. Daldal N, Özensoy S, Aksoy Ü, Akısü Ç. 1999. Besiyerleri ve Hayvan İnokülasyonları. İçinde: Özcel MA, Altıntaş N. (Eds). Parazit Hastalıklarında Tanı. İzmir: Türkiye Parazitoloji Derneği Yayını, No:15. 1999:149-82.
- 13. Toz SO, Culha G, Zeyrek FY et al. A real-time ITS1-PCR based method in the diagnosis and species identification of Leishmania parasite from human and dog clinical samples in Turkey. PLoS Negl Trop Dis. 2013;7(5):e2205. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002205
- 14. Rougemont M, Van Saanen M, Sahli R, Hinrikson HP, Bille J, Jaton K. Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNA gene subunitbased and species-specific real-time PCR assays. J Clin Microbiol. 2004;42(12):5636-43. https://doi.org/10.1128/JCM.42.12.5636-5643.2004
- 15. Selseleh M, Modarressi MH, Mohebali M et al. Realtime RT-PCR on SAG1 and BAG1 gene expression during stage conversion in immunosuppressed mice infected with Toxoplasma gondii Tehran strain. Korean J Parasitol. 2012;50(3):199-205. https://doi.org/10.3347/kjp.2012.50.3.199
- 16. Röser D, Simonsen J, Nielsen HV, Stensvold CR, Mølbak K. Dientamoeba fragilis in Denmark: epidemiological experience derived from four years of routine realtime PCR, Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2013;32(10):1303-10. https://doi.org/10.1007/s10096-013-1880-2
- 17. Abbasi I, Aramin S, Hailu A et al. Evaluation of PCR procedures for detecting and quantifying Leishmania donovani DNA in large numbers of dried human blood samples from a visceral leishmaniasis focus in Northern Ethiopia. BMC Infect Dis. 2013;27:13:153. https://doi.org/10.1186/1471-2334-13-153.
- 18. Mary C, Faraut F, Drogoul MP, et al. Reference values for Leishmania infantum parasitemia in different clinical presentations: quantitative polymerase chain reaction for therapeutic monitoring and patient followup. Am J Trop Med Hyg. 2006;75(5):858-63. https://doi.org/10.4269/ajtmh.2006.75.858
- 19. Ceccarelli M, Galluzzi L, Diotallevi A, et al. The use of kDNA minicircle subclass relative abundance to differentiate between Leishmania (L.) infantum and Leishmania (L.) amazonensis. Parasit Vectors. 2017;10(1):239. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2181-x
- 20. Eberhardt E, Van den Kerkhof M, Bulté D, et al. Evaluation of a pan-Leishmania spliced-leader RNA detection method in human blood and experimentally infected Syrian golden hamsters. J Mol Diagn. 2018;20(2):253-63. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2017.12.003
- 21. White NJ. Plasmodium knowlesi: the fifth human malaria parasite. Clin Infect Dis. 2008;46(2):172-3. https://doi.org/10.1086/524889
- 22. Özbilgin A, Çavuş İ, Yıldırım A, Gündüz C. Türkiye’deki ilk maymun sıtması: Bir Plasmodium knowlesi olgusu. Mikrobiyol Bul. 2016;50(3):484-90. https://doi.org/10.5578/mb.27788
- 23. Jarra W, Snounou G. Only viable parasites are detected by PCR following clearance of rodent malarial infections by drug treatment or immune responses. Infect Immun. 1998;66(8):3783-7.
- 24. Schussek S, Groves PL, Apte SH, Doolan DL. Highly sensitive quantitative real-time PCR for the detection of Plasmodium liver-stage parasite burden following low-dose sporozoite challenge. PLoS One. 2013;8(10):77811. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077811
- 25. Imwong M, Stepniewska K, Tripura R et al. Numerical distributions of parasite densities during asymptomatic malaria. J Infect Dis. 2016;213(8):1322-9. https://doi.org/10.1093/infdis/jiv596
- 26. Raju LS, Kamath S, Shetty MC, et al. Genome miningbased identification of identical multirepeat sequences in Plasmodium falciparum genome for highly sensitive real-time quantitative PCR assay and its application in malaria diagnosis. J Mol Diagn. 2019;21(5):824-38. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2019.04.004
- 27. Almeida-de-Oliveira NK, Moreira OC, de Lavigne AR, et al. Analytical validation of real-time quantitative PCR assays for optimum diagnosis of vivax malaria. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2019;114:e180350. https://doi.org/10.1590/0074-02760180350
- 28. Jauregui LH, Higgins J, Zarlenga D, Dubey JP, Lunney JK. Development of a real-time PCR assay for detection of Toxoplasma gondii in pig and mouse tissues. J Clin Microbiol. 2001;39(6):2065-71. https://doi.org/10.1128/JCM.39.6.2065-2071.2001
- 29. Kompalic-Cristo A, Frotta C, Suárez-Mutis M, Fernandes O, Britto C. Evaluation of a real-time PCR assay based on the repetitive B1 gene for the detection of Toxoplasma gondii in human peripheral blood. Parasitol Res. 2007;101(3):619-25. https://doi.org/10.1007/s00436-007-0524-9
- 30. Flori P, Hafid J, Bourlet T, Raberin H, Genin C, Sung RT. Experimental model of congenital toxoplasmosis in guinea-pigs: use of quantitative and qualitative PCR for the study of maternofetal transmission. J Med Microbiol. 2002;51(10):871-8. https://doi.org/10.1099/0022-1317-51-10-871
- 31. Asai T. The diagnosis of toxoplasmic encephalitis by polymerase chain reaction. Rinsho Shinkeigaku. 2013;23(11):1194-5. https://doi.org/10.5692/clinicalneurol.53.1194
- 32. Herrmann DC, Maksimov A, Pantchev N, Vrhovec MG, Conraths FJ, Schares G. Comparison of different commercial DNA extraction kits to detect Toxoplasma gondii oocysts in cat faeces. Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2011;124(11-12):497-502.
- 33. Escotte-Binet S, Da Silva AM, Cancès B, et al. A rapid and sensitive method to detect Toxoplasma gondii oocysts in soil samples. Vet Parasitol. 2019;274:108904. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2019.07.012
- 34. Sroka J, Karamon J, Dutkiewicz J, Wójcik-Fatla A, Cencek T. Optimization of flotation, DNA extraction and PCR methods for detection of Toxoplasma gondii oocysts in cat faeces. Ann Agric Environ Med. 2018;25(4):680-685. https://doi.org/10.26444/aaem/97402
- 35. Rahimi Esboei B, Kazemi B, Zarei M, et al. Evaluation of RE and B1 genes as targets for detection of Toxoplasma gondii by nested PCR in blood samples of patients with ocular toxoplasmosis. Acta Parasitol. 2019;64(2):384-9. https://doi.org/10.2478/s11686-019-00056-6
| APA | Oyur T, Kurt Ö, çavuş i, Ozbilgin A (2020). Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. , 56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| Chicago | Oyur Tuba,Kurt Özgür,çavuş ibrahim,Ozbilgin Ahmet Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. (2020): 56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| MLA | Oyur Tuba,Kurt Özgür,çavuş ibrahim,Ozbilgin Ahmet Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. , 2020, ss.56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| AMA | Oyur T,Kurt Ö,çavuş i,Ozbilgin A Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. . 2020; 56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| Vancouver | Oyur T,Kurt Ö,çavuş i,Ozbilgin A Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. . 2020; 56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| IEEE | Oyur T,Kurt Ö,çavuş i,Ozbilgin A "Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması." , ss.56 - 62, 2020. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| ISNAD | Oyur, Tuba vd. "Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması". (2020), 56-62. https://doi.org/10.5222/TMCD.2020.056 |
| APA | Oyur T, Kurt Ö, çavuş i, Ozbilgin A (2020). Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi, 50(1), 56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| Chicago | Oyur Tuba,Kurt Özgür,çavuş ibrahim,Ozbilgin Ahmet Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi 50, no.1 (2020): 56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| MLA | Oyur Tuba,Kurt Özgür,çavuş ibrahim,Ozbilgin Ahmet Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi, vol.50, no.1, 2020, ss.56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| AMA | Oyur T,Kurt Ö,çavuş i,Ozbilgin A Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi. 2020; 50(1): 56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| Vancouver | Oyur T,Kurt Ö,çavuş i,Ozbilgin A Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi. 2020; 50(1): 56 - 62. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| IEEE | Oyur T,Kurt Ö,çavuş i,Ozbilgin A "Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması." Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi, 50, ss.56 - 62, 2020. 10.5222/TMCD.2020.056 |
| ISNAD | Oyur, Tuba vd. "Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması". Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi 50/1 (2020), 56-62. https://doi.org/10.5222/TMCD.2020.056 |
