Mikroalgal Tabanlı Rekombinant Protein Ekspresyon Platformunun Geliştirilmesi

ÖKTEM ,HÜSEYİN AVNİ; YÜCEL ,Ayşe Meral

Proje Yürütücüsü:

HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM

(Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Ankara, Türkiye)

Ayşe Meral YÜCEL

(Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Ankara, Türkiye)

Proje Grubu: TÜBİTAK KBAG ProjeSayfa Sayısı: 89Proje No: 114Z487Proje Bitiş Tarihi: 15.08.2018Metin Dili: Türkçe

0 0

Türkçe
İngilizce

Mikroalgal Tabanlı Rekombinant Protein Ekspresyon Platformunun Geliştirilmesi

Öz: Proje kapsamında mikroalgal sistemler için etkin bir rekombinant protein ekspresyon platformunun gelistirilmesi arastırılmıstır. Yürütülen çalısmalar asagıda özetlenmektedir. Mikroalglrein kontrollü kosullarda heterofilik üretimi için maliyet etkin kültür yönteminin gelistirilmesi: Bu amaçla farklı kosullarda ve farklı karbon kaynakları kullanılarak algleri büyüme performansları degerlendirilerek alglerin verimli büyüdükleri sartlar belirlenmistir. TAP büyüme ortamının en yksek verimi sagladıgı belirlenmistir. Mikroalgal sistemlerde genetik modifikasyon için gerekli olan ekspresyon vektörlerinin olusturulması: Bu amaçla projede üretimi hedeflenen streptavidin geni ve GFP geni alg transformasyonunda kullanılabilecek plasmid yapısındaki vektörlere aktarılmıstır. Elde edilen vektörler moleküler biyolojik yöntemler ile dogrulanmıstır. Mikroalgal sistemlerde etkin ve stabil ekspresyon kosullarının arastırılması: GFP içerikli vektörler kullanılarak alg hücrelerinde elektroporasyon temelli bir transformasyon yöntemi optimize edilmistir. Bu yöntem kullanılarak streptavidin geni içeren vektör alg hücrelerine transforme edilmis, stabil transformasyon antibiyotikli besi yeri üzerinde jenerasyonlar boyunca büyütülen hücrelerde, muhtelif moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak dogrulanmıstır. Strepativin genini kromozomal olarak içeren alg hücreleri elde edilmistir. Strepatvidin proteininin algal sistemlerde üretimi: Gerekli transformasyon ekspresyon ve protein purifikasyon protokellerinin tamamı çalısılmıs ve ilgili prototkoller gelistitilmistir. Strepatvidin geninin hücrelere aktarılmıs ve ifadesinin ilk basamagı olan mRNA trnaskripsiyonunun dogrulanmıs olmasına karsın, protein izolasyonu sonucunda streptavidin proteininin elde edildigine dair net bir sonuca ulasılamamıstır. Ilerleyen dönemlerde kromozomal transformasyon yerine kloroplast transformasyonunun bu sorunu asabilecegi düsünülmektedir. Streptavidin poteinlerinin etkinliginin DNA çipleri ve yatay akıslı tanı platformlarında belirlenmesi: Streptavidinin etkinliginin belirlenmesi amacıyla DNA çipleri ve yatay akıslı test striplerinin ticari olarak temin edilen streptavidin ve projede elde edilen streptavidin ile hazırlanmıs ve karsılastırılmıstır. Alg hücrelerinden elde edilen streptavid ile istenen sonuçlara ulasılamamasına ragmen ticari olarak temin edilen streptavidin ile hazırlanan DNA çipleri ve test stripleri pozitif sonuçlar vermistir. Sonuç olarak proje öngörüsünde temel hedefimiz olan alg hücrelerinde rekombinant üretimi için gerekli olan tüm asamalara yönelik bilgi birikimi olusturularak ilgili yöntemlerin tümü optimize edilerek hayata geçirilmistir.

Abstract: Within the scope of the project, the development of an efficient recombinant protein expression platform for microalgae systems has been investigated. The studies carried out are summarized below. Development of a cost-effective culture method for heterophilic production of microalgae under controlled conditions: For this purpose, the conditions under which algae grow efficiently are evaluated by evaluating algal growth performance on different conditions and using different carbon sources. It has been determined that the TAP growth environment provides the highest yield. Creation of expression vectors necessary for genetic modification in microalgae systems: For this purpose, GFP gene of streptavidin produced were transferred to plasmid vectors which can be used for transformation of algae. The obtained vectors were confirmed by molecular methods. Investigation of effective and stable expression conditions in microalgae systems: An electroporation based transformation method was optimized in algal cells using GFPcontaining vectors. Using this method, the vector containing streptavidin gene was transformed into algal cells, and cells were shown to grown in antibiotic media for generations. Stable transformants crryin chromosamal streptavidin gene were verified using various molecular methods. Production of strepatvidin protein in algal systems: The required transformation expression and protein purification protocols have been studied and related prototols have been developed. Although the Strepatvidin gene was transferred to the cells and the mRNA transcription, the first step of the expression, was confirmed, no clear result was obtained that the protein isolation resulted in the streptavidin protein. It is thought that chloroplast transformation instead of chromosomal transformation can overcome this problem in future studies. Determination of the activity of streptavidin poteins in DNA chips and lateral flow diagnostic platforms: DNA chips and lateral flow test strips were prepared and compared with commercially available streptavidin and streptavidin obtained in the project to determine the efficacy of streptavidin. DNA chips and test strips prepared with commercially available streptavidin gave positive results, although the desired results could not be achieved with streptavid obtained from algae cells. As a result, all of the relevant methods have been optimized for the recombinant production of algal cells, which is our main target in the project proposal.

Kaynakça girilmemiştir.